茯苓四逆湯對(duì)老年膿毒癥大鼠心肌損傷及免疫麻痹的干預(yù)作用

王評(píng) 彭曉洪 黃亞秀 陳冬杰 胡世平

(深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,廣東 深圳 518172)

膿毒癥是指因感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙〔1〕。心臟是膿毒癥易受損的器官，40%～50%膿毒癥患者并發(fā)心肌損傷，其中約7%發(fā)生嚴(yán)重心力衰竭(心衰),并發(fā)心功能障礙的膿毒癥患者死亡率達(dá)70%〔2〕。年齡是膿毒癥發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，相比青壯年，老年人膿毒癥發(fā)病率高、遠(yuǎn)期預(yù)后更差，1年內(nèi)死亡率達(dá)59.7%〔3〕。既往普遍認(rèn)為過度的炎性反應(yīng)與膿毒癥器官損傷相關(guān)，近年來發(fā)現(xiàn)免疫麻痹才是膿毒癥患者死亡的主要原因〔4〕。免疫調(diào)節(jié)治療是膿毒癥近年來研究的熱點(diǎn)。本研究觀察茯苓四逆湯對(duì)老年膿毒癥大鼠心肌損傷及免疫麻痹的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 90只20月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量320～380 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司〔許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005〕，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.2 主要儀器 Fresco D-37520型離心機(jī)(美國(guó)賽默飛)，ADVIA240型全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)西門子)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN COULTER 公司XL型)，低溫冰箱。

1.3 試劑 心肌肌鈣蛋白(cTn)I、N-末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自上海仁捷生物科技有限公司；免疫球蛋白(Ig)G、IgM ELISA試劑盒購自研域(上海)化學(xué)試劑有限公司。茯苓四逆湯(茯苓30 g、熟附子10 g、人參5 g、干姜8 g、炙甘草10 g)由廣東省深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院藥劑科提供(深圳市正皇莊中藥飲片有限公司配送)，濃煎成含原生藥1 g/ml的溶液，過濾除菌分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分組及造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、假手術(shù)組、模型組、茯苓四逆湯低(1.3 g/d)、中(2.6 g/d)、高(3.9 g/d)劑量組，各15只。參考文獻(xiàn)〔5〕采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)制備膿毒癥大鼠模型，術(shù)前12 h禁食，自由飲水，腹腔注射0.4 ml/kg 10%水合氯醛麻醉，腹部備皮消毒，全身75%酒精擦拭消毒后放入超凈工作臺(tái)并固定于手術(shù)臺(tái)。劍突下約2 cm處沿腹正中線剪開腹壁約1 cm，找出盲腸，5號(hào)線結(jié)扎約1/3盲腸，18G針頭貫通穿刺結(jié)扎部位的盲腸2次，輕輕擠壓使少量腸內(nèi)容物溢出，將處理好的盲腸回納腹腔，縫合腹腔。術(shù)畢頸后皮下注射10 ml生理鹽水復(fù)蘇，將大鼠置于37℃加熱板上等待蘇醒。假手術(shù)組開腹，除盲腸結(jié)扎及穿刺，余同模型組。正常組不進(jìn)行麻醉及開腹手術(shù)。

1.5 給藥方法 大鼠自由飲水正常進(jìn)食，單獨(dú)飼養(yǎng)。茯苓四逆湯各劑量組灌胃劑量參照血清藥理學(xué)等效劑量換算公式換算〔6〕，350 g大鼠等效劑量折算為2.1 g，低、中、高劑量分別為1倍(2.1 g/d)、2倍(4.2 g/d)、3倍(6.3 g/d)，用生理鹽水稀釋至10 ml，造模后6 h開始灌胃，每日劑量分兩次給藥，持續(xù)3 d，正常組、假手術(shù)組及模型組相同時(shí)間點(diǎn)給予等量生理鹽水灌胃。

1.6 觀察指標(biāo) 每天觀察大鼠的生存狀態(tài)和生存時(shí)間。各組于造模后24、48、72 h各取5只大鼠尾靜脈取血并處死。大鼠尾靜脈血離心后取血清，采用ELISA法檢測(cè)血清cTnI、NT-proBNP含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書。流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)、自然殺傷(NK)細(xì)胞。ELISA法測(cè)定免疫球蛋白IgG、IgM，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠行為及生存狀態(tài)觀察 正常組食欲正常，精神良好，毛發(fā)光滑，活動(dòng)自如；假手術(shù)組術(shù)后飲食、活動(dòng)量先下降，后逐漸恢復(fù)正常；模型組普遍精神萎靡，食欲下降，呼吸頻率加快，毛發(fā)蓬松無光澤，大便稀軟；中藥各劑量組也普遍出現(xiàn)食欲下降，精神萎靡、活動(dòng)度下降，毛發(fā)蓬松無光澤，大便稀軟等癥狀，但24 h后癥狀逐漸改善，改善程度好于模型組，且隨著中藥劑量增大癥狀改善越明顯。各組均無死亡。

2.2 血清心肌損傷指標(biāo)比較 與正常組比較，假手術(shù)組血清cTnI、NT-proBNP水平有所上升，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；模型組血清cTnI、NT-proBNP水平持續(xù)升高，72 h下降，較正常組同時(shí)間點(diǎn)均明顯升高(P<0.01)；中藥各劑量組血清cTnI、NT-proBNP水平均升高，48 h逐漸下降，各時(shí)間點(diǎn)較正常組均明顯上升(P<0.05，P<0.01)。中藥各劑量組血清cTnI、NT-proBNP水平同時(shí)間點(diǎn)均低于模型組(P<0.05，P<0.01)，中藥各組間24 h 血清cTnI、NT-proBNP水平對(duì)比無顯著差異(P>0.05)，48 h、72 h高劑量組cTnI、NT-proBNP水平較低劑量組顯著下降(P<0.05)，中、低劑量組間無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.3 T淋巴細(xì)胞比較 正常組、假手術(shù)組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較無顯著差異(P>0.05)；模型組CD4+、CD4+/CD8+下降，CD8+升高，48 h達(dá)峰值，與正常組同時(shí)間點(diǎn)比較均有顯著差異(P<0.01)；與正常組比較，高劑量組各指標(biāo)24 h、48 h有顯著差異(P<0.05，P<0.01)，72 h無顯著差異(P>0.05)，低、中劑量組間各指標(biāo)同時(shí)間點(diǎn)與正常組比較均有顯著差異(P<0.05，P<0.01)；中藥各組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+同時(shí)間點(diǎn)均較模型組顯著改善(P<0.05，P<0.01)；低、中劑量組各指標(biāo)同時(shí)間點(diǎn)比較無顯著差異(P>0.05)，48 h、72 h高劑量組CD4+、CD4+/CD8+改善優(yōu)于低劑量組(P<0.01)，高劑量組72 h CD8+改善優(yōu)于低劑量組(P<0.01)。見表2。

表1 各組血清心肌損傷指標(biāo)比較

與正常組比較:1)P<0.05,2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01；與低劑量組比較:5)P<0.05；下表同

表2 各組T淋巴細(xì)胞亞群的比較

2.4 NK細(xì)胞、IgG、IgM比較 正常組、假手術(shù)組NK細(xì)胞、IgG、IgM比較無顯著差異(P>0.05)；模型組NK細(xì)胞、IgG、IgM下降，48 h達(dá)峰值，較正常組同時(shí)間點(diǎn)均明顯降低(P<0.01)；中藥各組上述指標(biāo)24 h后逐漸上升，高劑量組24 h、48 h NK細(xì)胞、IgG、IgM均較正常組降低(P<0.05，P<0.01)，72 h無顯著差異(P>0.05)，低、中劑量組各指標(biāo)同時(shí)間點(diǎn)均低于正常組(P<0.05，P<0.01)；中藥各組NK細(xì)胞、IgG、IgM同時(shí)間點(diǎn)均較模型組改善(P<0.05，P<0.01)；低、中劑量組各指標(biāo)同時(shí)間點(diǎn)比較無顯著差異(P>0.05)，48 h、72 h高劑量組NK細(xì)胞、IgM改善優(yōu)于低劑量組(P<0.01)，72 h IgG改善優(yōu)于低劑量組(P<0.01)。見表3。

表3 各組NK細(xì)胞、IgG、IgM比較

3 討 論

老年人基礎(chǔ)病多、免疫功能低下，更易發(fā)生膿毒癥，研究顯示，64.9%的膿毒癥患者為老年人〔7〕，其死亡率較非老年患者更高。心肌損傷是膿毒癥患者常見并發(fā)癥及死因，其主要表現(xiàn)為心室收縮、舒張功能障礙，射血分?jǐn)?shù)減少，對(duì)容量反應(yīng)性差，血清心肌損傷標(biāo)志物異常升高等。cTnI是心肌損傷的特異性標(biāo)志物。膿毒癥患者入重癥加強(qiáng)護(hù)理病房(ICU)24 h cTnI已普遍升高，并發(fā)心功能障礙的升高更明顯，且其升高程度與死亡率密切相關(guān)〔8〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，膿毒癥大鼠血清cTnI明顯升高，且符合心肌損傷病理改變〔9〕。NT-proBNP是反映心功能不全的可靠指標(biāo)，膿毒癥患者血清NT-proBNP隨著心衰程度加重而升高，早于cTnI出現(xiàn)，發(fā)病3 h內(nèi)已升高〔10〕。可見，cTnI、NT-proBNP從心肌損傷、心功能不同側(cè)面反映了膿毒癥對(duì)心臟的損害。本研究提示膿毒癥心肌損傷、心功能障礙持續(xù)存在。

膿毒癥屬于中醫(yī)學(xué)“熱病”“溫病”等范疇，基本病機(jī)是正虛毒損，屬本虛標(biāo)實(shí)之證。長(zhǎng)期以來，本病研究以清熱解毒、化痰通絡(luò)、通腑瀉下等治法居多，直至休克、心衰等癥方予回陽救逆之品。《素問·遺篇·刺法論》云：“正氣存內(nèi),邪不可干,邪之所湊,其氣必虛”。闡述了膿毒癥發(fā)病的根本在于正氣虧虛。《素問·陰陽應(yīng)象大論》云：“壯火之氣衰，少火之氣壯。壯火食氣……少火生氣”，膿毒癥常伴高熱，必然戳戮正氣，甚則陽氣迅速耗散乃至陽氣厥脫。本研究認(rèn)為，膿毒癥心肌損傷乃毒熱傷正，陽氣耗竭，陽損及陰，水濕瘀血內(nèi)停，以致變證迭起。治以溫陽育陰利水為法，方選茯苓四逆湯。茯苓四逆湯出自《傷寒論》第69 條“發(fā)汗，若下之，病仍不解，煩躁者，茯苓四逆湯主之”。原方由茯苓、人參、干姜、附子、炙甘草組成，其中茯苓重用健脾利水，人參益氣生津養(yǎng)陰，干姜、附子、炙甘草為四逆湯回陽救逆、少火生氣。前期研究發(fā)現(xiàn)茯苓四逆湯能夠改善慢性心衰患者心功能〔11〕。有報(bào)道〔12〕，溫陽益氣活血類中藥能夠顯著改善膿毒癥心肌損傷患者預(yù)后。本研究結(jié)果提示茯苓四逆湯明顯減輕老年膿毒癥大鼠心肌損傷并有效改善心功能。

膿毒癥心肌損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，傳統(tǒng)認(rèn)為，TOLL樣受體(TLR)介導(dǎo)的炎性反應(yīng)誘導(dǎo)心肌損傷，其信號(hào)通路TLR4/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB/腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6被認(rèn)為是膿毒癥心肌損傷的主要發(fā)病機(jī)制〔13〕，然而眾多以抗炎為主的臨床研究并未提示結(jié)局改善〔14〕。近年來認(rèn)為，免疫麻痹是膿毒癥患者的主要死因〔4〕。免疫麻痹主要表現(xiàn)為人體免疫抑制，淋巴細(xì)胞的增殖能力下降及凋亡，輔助性T 細(xì)胞免疫無反應(yīng)，CD4+T淋巴細(xì)胞減少，CD4+/CD8+比例降低，NK細(xì)胞、IgG、IgM等相應(yīng)下降，以致機(jī)會(huì)性感染增加〔15〕。研究證實(shí)膿毒癥初期免疫麻痹即出現(xiàn)，全身炎癥反應(yīng)綜合征與免疫麻痹貫穿于疾病始終〔16〕。免疫麻痹與膿毒癥心肌損傷的研究目前少見，本研究提示膿毒癥大鼠初期即存在嚴(yán)重的免疫抑制，隨著病情進(jìn)展免疫麻痹逐漸加重，與血清cTnI、NT-proBNP水平變化趨勢(shì)一致。可見，免疫抑制是心肌損傷的一個(gè)重要因素。

膿毒癥心肌損傷屬正虛邪實(shí)，扶正祛邪為基本治則。本研究以茯苓四逆湯扶正為主可明顯減輕膿毒癥大鼠免疫抑制、增強(qiáng)免疫功能，進(jìn)而促使損傷心肌修復(fù)。