脫氫表雄酮抑制高脂誘導的血小板源生長因子表達及細胞色素P450芳香酶基因在其中的作用

周穎 趙敏 李桃 陳艷昕 黃江梅

(秦皇島市第一醫院病理科，河北 秦皇島 066000)

脫氫表雄酮(DHEA)是人體內最豐富的來源于腎上腺的甾體激素。研究顯示DHEA有抗動脈粥樣硬化(AS)作用〔1,2〕，但其機制尚不清楚。血小板源生長因子(PDGF)具有趨化作用，是AS發生發展過程中的主要因子〔3～5〕。本研究擬觀察DHEA對高脂誘導的兔主動脈及人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)PDGF表達的影響，同時觀察過表達細胞色素P450芳香酶基因(CYP19)能否增強DHEA的抗AS作用，從而探討DHEA抗AS的可能機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養和分組 用胰酶消化法原代培養HUVEC，并傳代。將生長良好的HUVEC更換無血清DMEM/F12培養基培養12 h后隨機分成6組：①正常對照組無血清培養基；②氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)組無血清培養基+35 mg/L ox-LDL；③ox-LDL+DHEA(低濃度)組無血清培養基+35 mg/L ox-LDL+0.1 μmol/L DHEA(Fluka公司)；④ox-LDL+DHEA(高濃度)組無血清培養基+35 mg/L ox-LDL+1.0 μmol/L DHEA；⑤ox-LDL+DHEA+全反式維甲酸(ATRA)組無血清培養基+35 mg/L ox-LDL+1.0 μmol/L DHEA+0.01 μmol/L ATRA；⑥DHEA組無血清培養基+1.0 μmol/L DHEA。24 h后收集細胞及上清液。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測HUVEC PDGF mRNA的表達 按Trizol(Invitrogen公司)試劑盒說明書分別提取各組HUVEC總RNA，反轉錄獲得cDNA，采用實時熒光定量PCR試劑盒進行PCR。反應條件：95℃ 3 min；94℃ 20 s，58℃ 20 s， 68℃ 20 s，40個循環。GAPDH基因為內參，運用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。PCR引物由Gene Copoeia 公司合成，PDGF上游引物序列為5′-CTCCATCCGCTCCTTTGAT-3′，下游引物序列為5′-ACTTTCGGTGCTTGCCTTT-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GCTGGGGCTCACCTGAAGGG-3′，下游引物序列為5′-GGATGACCTTGCCCACAGCC-3′ 。

1.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測HUVEC PDGF蛋白的表達 在含有PDGF酶標抗體(mAb)包被的酶標板上，加入不同濃度的PDGF標準品和收集的各組HUVEC上清液各0.1 ml，37℃孵育1 h，加入辣根過氧化物酶標記的工作液37℃孵育1 h，鄰苯二胺底物液暗處反應10 min，終止。酶標儀492 nm處的測吸光度值(A)表示PDGF蛋白，根據標準曲線得出相應的PDGF蛋白量。

1.4 HUVEC轉染 采用脂質體轉染法，將pcDNA3.1-CYP19-綠色熒光蛋白(GFP)真核表達質粒體外轉染至HUVEC(CYP19轉染組)，按LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑盒(Invitrogen公司) 說明書操作。同時以轉染空質粒pcDNA3.1-GFP(空質粒組)及未經轉染的HUVEC(未轉染組)作為對照。

1.5 實時熒光定量PCR檢測轉染后 CYP19 mRNA的表達 按Trizol試劑盒說明書提取轉染48 h后的1.4中3組細胞的總RNA，反轉錄獲得cDNA，采用實時熒光定量PCR試劑盒進行PCR。反應條件：95℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s， 72℃ 30 s，40個循環。GAPDH基因為內參，運用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。CYP19上游引物序列為5′-TGGAAGGATGCACAGACTCG-3′，下游引物序列為5′-TGACCAGCCTTCTCTAGTGTTCC-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GCTGGGGCTCACCTGAAGGG-3′，下游引物序列為5′-GGATGACCTTGCCCACAGCC-3′ 。

1.6 轉染細胞分組及PDGF表達的檢測 將轉染后的HUVEC分為6組：①CYP19組：無血清培養基；②CYP19+ox-LDL組：無血清培養基+35 mg/L ox-LDL；③CYP19+ox-LDL+DHEA組：無血清培養基+35 mg/L ox-LDL+1.0 μmol/L DHEA；④空質粒組：無血清培養基；⑤空質粒+ox-LDL組：無血清培養基+35 mg/L ox-LDL；⑥空質粒+ox-LDL+DHEA組：無血清培養基+35 mg/L ox-LDL+1.0 μmol/L DHEA。各組轉染細胞在藥物作用24 h后，用實時熒光定量PCR和ELISA法分別檢測PDGF mRNA和蛋白的表達，方法同1.2和1.3。

1.7 動物模型的制備和分組 新西蘭大耳白兔25只，體重2.5～3.0 kg，成年雄性。平均分成5組：①正常對照組：常規飼料。②高脂組：高脂飼料(1%膽固醇、3%豬油)。③高脂+DHEA組：高脂飼料+0.3% DHEA。④高脂+DHEA+ATRA組：高脂飼料+0.3% DHEA+0.5 mg/(kg·d)ATRA。⑤單DHEA組：常規飼料+0.3% DHEA。各組按以上飲食喂養10 w后處死，從主動脈弓處取兩段動脈壁，一段-80℃冰箱凍存，另一段4%多聚甲醛固定。

1.8 實時熒光定量PCR檢測主動脈PDGF mRNA表達 按Trizol試劑盒說明書分別提取各組凍存兔主動脈的總RNA，反轉錄獲得cDNA，采用實時熒光定量PCR試劑盒進行PCR。反應條件：95℃ 3 min；94℃ 20 s，58℃ 20 s， 72℃ 20 s，40個循環。GAPDH基因為內參，運用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。PDGF上游引物序列為5′-TGCGGATACCTCGCCCAT-3′，下游引物序列為5′-GGTCGACCTGACTCCTGG-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTT-3′，下游引物序列為5′-TGCCGAAGTGGTCGTGGATGACCT-3′。

1.9 免疫組化法檢測主動脈PDGF蛋白表達 將用多聚甲醛固定好的主動脈石蠟包埋切片。石蠟切片脫蠟、水化后，用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法染色(福州邁新生物技術開發公司)：3%過氧化氫滅活內源性過氧化氫酶，微波抗原修復，山羊血清封閉，滴加1∶400稀釋的兔抗兔PDGF多克隆抗體，滴加1∶1稀釋的酶標二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，常規脫水、封片。各組PDGF蛋白的相對表達量以細胞內棕黃色顆粒的平均吸光度值(A)表示，采用Image J圖像分析系統檢測。

1.10 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，SNN-q檢驗。

2 結 果

2.1 HUVEC PDGF mRNA和蛋白表達 ox-LDL組PDGF mRNA和蛋白表達較正常對照組明顯升高(P<0.05)。ox-LDL+DHEA(低濃度)組、ox-LDL+DHEA(高濃度)組、ox-LDL+DHEA+ATRA組、DHEA組、PDGF mRNA和蛋白表達與ox-LDL組比較均明顯降低(P<0.05)。與ox-LDL+DHEA(高濃度)組比較，ox-LDL+DHEA(低濃度)組PDGF mRNA和蛋白質表達顯著增加(P<0.05)，正常對照組、DHEA組PDGF mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組HUVEC PDGF mRNA及蛋白表達

與ox-LDL組比較:1)P<0.05；與ox-LDL+DHEA(高濃度)組比較:2)P<0.05

2.2 CYP19轉染HUVEC后其mRNA表達 CYP19轉染組CYP19 mRNA的表達(4.06±0.20)均高于空質粒組(1.09±0.19)及未轉染組(1.00±0.15，P<0.05)。

2.3 轉染CYP19對PDGF表達的影響 CYP19+ox-LDL+DHEA組PDGF mRNA及蛋白的表達較空質粒+ox-LDL+DHEA組均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組轉染細胞PDGF mRNA及蛋白的表達

與CYP19+ox-LDL組比較:1)P<0.05；與CYP19+ox-LDL+DHEA組比較:2)P<0.05

2.4 主動脈PDGF mRNA和蛋白的表達 高脂組PDGF mRNA和蛋白的表達較正常對照組明顯升高(P<0.05)，表現為明顯增厚的內膜中見大量棕黃色顆粒。高脂+DHEA組PDGF mRNA和蛋白的表達較高脂組明顯降低(P<0.05)，內膜厚度較高脂組薄，內膜中棕黃色顆粒的數量較高脂組少、顏色較高脂組淡。單DHEA組與正常對照組、高脂+DHEA+ATRA組與高脂+DHEA組PDGF mRNA和蛋白表達均無顯著性差異(均P>0.05)。見表3，圖1。

表3 各組主動脈PDGF mRNA及蛋白的表達

與高脂組比較:1)P<0.05；與高脂+DHEA組比較:2)P<0.05

圖1 各組主動脈PDGF蛋白表達情況 (SP，×100)

3 討 論

DHEA是性激素合成的前體物質〔6〕， DHEA 及脫氫表雄酮硫酸鹽(DHEAS)血清水平隨著成人年齡的增長而不斷降低，研究認為它們的缺乏可能與AS等許多老年性慢性疾病的病理生理學發生機制相關〔7,8〕。研究者在老年男性和更年期婦女中發現〔9〕，調整年齡后，高水平的DHEA與頸動脈內膜-中膜厚度呈負相關，提示老年人生理范圍內的DHEA與頸AS的危險性有關。劉佳〔10〕研究發現，DHEA 可抑制由PDGF-BB誘導的絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性，進而抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖。本研究模型組兔主動脈內膜有明顯脂紋形成，表明模型構建成功。以往研究結果顯示DHEA對血脂水平的影響不大，DHEA的抗AS作用不依賴于血脂水平的改變〔11〕。本研究結果提示DHEA能夠抑制兔主動脈及HUVEC PDGF的表達。DHEA單獨存在時對PDGF的表達無明顯影響。由此推斷，DHEA能夠特異性的抑制高脂誘導的PDGF表達是其抗AS的機制之一。

DHEA在體內主要是在細胞內CYP19的作用下降解成雌酮而發揮作用〔12,13〕。由此推想，過表達CYP19，增加細胞內CYP19的活性，應該可以特異性地加強DHEA在血管局部發揮的抗AS作用。本實驗說明過表達CYP19能夠增強DHEA抑制高脂誘導的PDGF表達的作用。同時本課題組另有實驗也已證明過表達CYP19同樣能夠增強DHEA抑制高脂誘導的基質金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-2、巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-1α表達的作用〔14～16〕。研究指出，CYP19具有多個啟動子，在血管內皮細胞中由啟動子1.6發揮作用，推測補充ATRA可以激活維甲酸受體，后者被激活后可通過1.6啟動子增強CYP19表達〔17〕，從而增強DHEA的抗AS作用。本研究推測可能由于ATRA通過1.6啟動子對CYP19表達的增強是有限的，ATRA能否增強DHEA的抗AS作用及其可能機制有待進一步研究。