自噬在高糖條件下視網膜色素上皮細胞表達血管內皮生長因子促進RF/6A細胞血管生成中的作用△

李蓉 姚楊 杜軍輝 姚國敏 王小娣 張進

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見的嚴重微血管并發癥，也是全球工作人群致盲的首位眼病[1-2]。DR發生的病理機制十分復雜，普遍認為，高血糖是導致視網膜微血管慢性損傷的主要因素，最終促使病理性視網膜新生血管形成，即疾病晚期進入增生型DR(proliferative DR，PDR)期，從而嚴重威脅患者視力[3]。視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)可分泌多種細胞因子，其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促進新生血管形成的關鍵因子[4-6]。有研究證實，VEGF與眼內新生血管疾病的發生發展密切相關，VEGF的增加可顯著促進PDR患者視網膜新生血管的形成[7]。

自噬是一種細胞內降解機制，通過溶酶體降解自身細胞質成分來滿足細胞自身的代謝需要及細胞器的更新，從而維持細胞內環境穩態[8]。我們前期研究發現，缺氧或高糖條件下的自噬激活能夠顯著促進視網膜內皮細胞RF/6A的遷移和管腔樣結構的形成[9-10]。RPE在生理狀態下保持著基本的自噬水平，且隨著年齡增長和疾病發生而改變[11]。基于此，本研究觀察高糖條件下人RPE細胞自噬水平的變化對其VEGF蛋白表達、RF/6A細胞遷移和管腔樣結構形成的影響，為進一步研究自噬在DR中的作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料人RPE細胞株(ARPE-19，取5～10代細胞用于實驗)、RF/6A細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司)；DMEM培養基、2.5 g·L-1胰蛋白酶及胎牛血清(美國Gibco公司)；青霉素、鏈霉素(美國Hyclong公司)；Transwell小室、Matrigel基質膠(美國BD公司)；3-MA(美國Selleck公司)；兔多抗自噬標志性蛋白微管相關蛋白1 輕鏈 3(microtubule-related protein 1 light chain 3，LC3)B(#2775)，兔多抗Beclin-1(#3738)(美國Cell signaling公司)，兔抗人自噬相關的特異性基因3(autophagy-related gene 3，Atg3；……