活血益氣方促缺氧人臍靜脈內皮細胞遷移及其相關調控基因mRNA表達的拆方研究

活血益氣方是基于冠心病氣虛血瘀病機構建的臨床經(jīng)驗方，前期多項動物實驗研究證實本方可激活血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達，促進心肌梗死后血管新生，增加心肌側支循環(huán)的建立，具有提高后心力衰竭心臟功能和逆轉左室重構改善心肌缺血的作用[1-4]。從細胞機制來講，血管內皮細胞是缺血性心臟病中血管新生的主要靶細胞，內皮細胞的增殖及其與基底膜解離并穿過血管壁移行到血管周圍間隙，進而黏附、芽生，形成管腔結構等一系列過程是血管新生的關鍵步驟[5]。人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)是研究血管生成的主要細胞，通過檢測HUVEC的增殖及遷移能力可用于評估血管生成的能力。前期研究表明，活血益氣方及其拆方可明顯促進缺氧后HUVEC的增殖并抑制其凋亡，作用機制可能與調節(jié)PKC/Ras/ Raf-1信號通路和減少氧化應激損傷有關[6]。然而，活血益氣方及其拆方對內皮細胞增殖之后其他重要環(huán)節(jié)的調控作用尚未可知。為進一步明確活血益氣方及其拆方促血管新生的細胞機制及配伍規(guī)律，本研究通過建立HUVEC缺氧模型模擬心肌缺血缺氧的病理環(huán)境，觀察活血益氣方及其拆方藥物血清對缺氧HUVEC遷移能力的影響，并通過研究其對細胞遷移粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)和應激活化蛋白激酶-2(mitogen-activated protein kinases-2，p38)-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的作用，進一步探索活血益氣方促進內皮細胞遷移的分子調控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及動物 原代人臍靜脈內皮細胞(Scien Cell研究實驗室，批號：15482)。成年健康雄性SD大鼠32只，7周齡，體重230～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內科學教育部重點實驗室SPF級屏障動物房，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥物及試劑 活血益氣方：黃芪60 g，黨參60 g，丹參10 g，川芎10 g，赤芍10 g，紅花10 g；活血方：丹參10 g，川芎10 g，赤芍10 g，紅花10 g；益氣方：黃芪60 g，黨參60 g。所有藥物均采用免煎顆粒，由北京康仁堂醫(yī)藥有限公司提供，常溫干燥保存。ECM培養(yǎng)基、胰酶/EDTA消化液、胰酶中和液、牛源纖維粘連蛋白(Scien Cell研究實驗室，批號分別為21430，18898，18952，17573)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、4%多聚甲醛、1%結晶紫染色液(Solarbio科技有限公司，批號分別為20170221，20160425，20160811)；Trizol試劑(Ambion公司，批號101004)；反轉錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific，批號00337818)；SYBR Select Master Mix(Applied Biosystems，批號1610048)；Transwell Insert (Merck-millipore，批號M151315)。

1.3 主要儀器 EQR/GL-41A超凈工作臺(ESCO公司)，IMT-2倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，MCO-20AIC CO2細胞培養(yǎng)箱(SANYO公司)，MiniGalaxy A三氣培養(yǎng)箱(RS biotech公司)，GeneAmp PCR system 9700基因擴增儀(美國AB 公司)，Mx3000P實時熒光定量PCR儀(美國安捷倫科技公司)，Gene Quant紫外分光光度計(Pharmacia Biotech公司)。

1.4 藥物血清制備 將32只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為正常對照組、活血益氣方組、活血方組和益氣方組，每組8只。參照文獻[2]，按照活血益氣方組16.086 g/(kg·d)，活血方組4.016 4 g/(kg·d)，益氣方組12.049 2 g/(kg·d)的劑量，5 mL/kg體重給予大鼠相應藥物灌胃，正常對照組灌服等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。采血前12 h禁食不禁水，末次給藥后1 h，將大鼠按5 mL/kg體重腹腔注射7%水合氯醛進行麻醉。待大鼠完全麻醉后，備皮，無菌腹主動脈取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，合并同組血清，56 ℃滅活30 min，分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 HUVEC缺氧模型的建立及分組給藥 參照文獻[6]，取對數(shù)生長期的HUVEC均勻接種于纖維粘連蛋白(2 μg/cm2)預包被的細胞培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，換用含0.5%胎牛血清的ECM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。繼續(xù)換用完全ECM培養(yǎng)基(5%胎牛血清、1%內皮細胞生長添加物)，將細胞置于缺氧培養(yǎng)箱(37 ℃、1%O2、5%CO2、94%N2)中培養(yǎng)24 h，建立缺氧HUVEC細胞模型，另設相應的正常對照組細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將缺氧HUVEC分為缺氧組、活血益氣方組、活血方組、益氣方組。藥物組分別換用含活血益氣方、活血方、益氣方藥物血清的ECM培養(yǎng)基(10%相應藥物血清、1%內皮細胞生長添加物)，正常對照組和缺氧組換用含10%正常對照血清的ECM培養(yǎng)基干預24 h。

1.6 Transwell Insert檢測細胞遷移 建立細胞缺氧模型后，0.25%胰酶消化收集細胞，采用基礎ECM培養(yǎng)基制成單細胞懸液。將Transwell Insert置于24孔板中，下層小室中加入600 μL含10%相應藥物血清的ECM培養(yǎng)基，將細胞按1×105個/孔均勻加入上層小室，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取出上層小室，用棉簽輕拭去小室內的細胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色15 min，倒置顯微鏡下觀察微孔濾膜下表面的細胞，每組設3個復孔，每個樣本隨機選擇5個高倍鏡視野(×200)進行細胞計數(shù)。

1.7 實時熒光定量PCR法檢測細胞FAK、p38、MAP激酶活化蛋白激酶(MAPKAPK)、熱休克蛋白27(HSP27)mRNA表達 將細胞按1×105/孔均勻接種于6孔板中，建立細胞缺氧模型，藥物干預24 h后，收集細胞。采用Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度計測定吸光度A260/A280，計算其濃度及純度。按照反轉錄試劑盒說明書將所提取的RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測，每組設5個復孔。循環(huán)參數(shù)為預變性95 ℃、10 min，變性95 ℃、1 min，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、20 s，共40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參照。目的基因引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成，目的基因引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列

2 結 果

2.1 活血益氣方及其拆方對缺氧HUVEC遷移的影響 與正常對照組比較，缺氧組細胞遷移數(shù)顯著減少(P<0.01)。與缺氧組比較，活血益氣方組、活血方組及益氣方組細胞遷移數(shù)均顯著增加(P<0.05或P<0.01)。活血益氣方組細胞遷移數(shù)高于活血方組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；益氣活血方組高于益氣方組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2、圖1。

組別只數(shù) 細胞遷移數(shù)正常對照組3236.867±5.015缺氧組3118.333±5.0991)活血益氣方組3149.733±3.5801)3)活血方組3133.400±3.3001)2)4)益氣方組3143.867±5.4971)3)

與正常對照組比較，1)P<0.01；與缺氧組比較，2)P<0.05，3)P<0.01；與活血益氣方組比較，4)P<0.05

2.2 活血益氣方及其拆方對FAK、p38、MAPKAPK、HSP27 mRNA表達的影響 與正常對照組比較，缺氧組細胞FAK、p38、MAPKAPK、HSP27mRNA表達均顯著下調(P<0.01)。與缺氧組比較，活血益氣方組、活血方組、益氣方組細胞FAK、p38 mRNA表達水平顯著上升(P<0.05或P<0.01)；活血益氣方組、益氣方組細胞MAPKAPK mRNA表達水平顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，活血方組細胞MAPKAPKmRNA表達上升，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；活血益氣方組HSP27 mRNA表達水平顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，活血方組、益氣方組HSP27 mRNA表達水平上升，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表3。

3 討 論

活血益氣方由黃芪、黨參、丹參、川芎、赤芍、紅花等藥物組成，方中黃芪、黨參相須相使，達補氣培元的功效，使五臟得養(yǎng)，心氣得充，配以丹參、川芎等藥物活血養(yǎng)血，則心氣得以血氣之濡養(yǎng)，可理氣活血、化瘀止痛，在臨床應用中得到顯著療效。此外，大量基礎研究表明，活血益氣方可顯著增加大鼠心肌梗死邊緣區(qū)微血管密度，促進血管新生[1-4]。

血管內皮細胞透過血管壁發(fā)生遷移是新血管形成的關鍵環(huán)節(jié)，當內皮細胞移行至血管周圍間隙時，可通過進一步的黏附與增殖形成血管芽，再經(jīng)過周圍細胞的包繞逐漸形成新的血管。本實驗結果顯示，缺氧后HUVEC遷移能力顯著受到抑制，活血益氣方及其拆方可明顯改善缺氧對HUVEC遷移的損傷。前期研究發(fā)現(xiàn)活血益氣方及其拆方還可促進缺氧HUVEC增殖并抑制其凋亡[6]，顯示出活血益氣方顯著的促血管新生效用，并提示其作用機制可能與靶向內皮細胞調控相關信號通路促進缺氧后內皮細胞增殖與遷移并減少其凋亡有關。多項研究表明，活血益氣方中的主藥黃芪、丹參、川芎、赤芍以及丹參配伍黃芪、川芎配伍黃芪等。對血管內皮細胞的遷移能力均具有明顯促進作用[7-9]。

A、B、C分別為正常對照組倒置顯微鏡下40倍、100倍、200倍視野；D、E、F分別為缺氧組倒置顯微鏡下40倍、100倍、200倍視野；G、H、I分別為活血益氣方組倒置顯微鏡下40倍、100倍、200倍視野；J、K、L分別為活血方組倒置顯微鏡下40倍、100倍、200倍視野；M、N、O分別為益氣方組倒置顯微鏡下40倍、100倍、200倍視野

圖1各組HUVEC遷移情況

表3 各組對缺氧HUVEC FAK、p38、MAPKAPK、HSP27 mRNA表達水平的影響(±s)

與正常對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與缺氧組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

細胞遷移是一種動態(tài)的、多步驟的生理病理過程，包括細胞前緣突出，與細胞外基質形成粘著斑，局灶性粘連的周轉，繼而產(chǎn)生牽引力等[10]。FAK是一種細胞質酪氨酸激酶，可加強局灶性粘連周轉過程。在VEGF介導的信號通路中，活化的FAK與Src家族激酶形成復合物，通過磷酸化其他蛋白質啟動多個下游信號傳導途徑，以介導各種細胞的遷移[11]，是細胞運動和細胞存活的正向調節(jié)因子[12-13]。FAK是VEGFR-2和整合素αvβ3之間的融合信號點，它控制了在內皮細胞遷移過程中調節(jié)肌動蛋白聚合所必需的局灶性粘連的組裝/拆卸[14]。FAK基因敲除小鼠引起胚胎早期致死性與廣泛的心血管缺陷[15]。

此外，p38-MAPK信號通路是VEGF誘導內皮細胞遷移的另一重要靶向途徑。VEGF可通過刺激p38，進而導致MAP激酶活化蛋白激酶-2/3(mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase-2/3，MAPKAPK-2/3)和絲狀肌動蛋白聚合調節(jié)分子及HSP27的激活，將VEGF信號傳遞到微絲，誘導調節(jié)細胞遷移的肌動蛋白細胞骨架的重排，最終產(chǎn)生內皮細胞移行[16]。FAK介導的局灶性粘連周轉以及p38介導的肌動蛋白聚合在促進形成應激纖維中具有互補作用，這些結構產(chǎn)生牽引細胞所需的收縮力，從而使內皮細胞定向遷移[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，活血益氣方及其拆方可不同程度地上調缺氧抑制的FAK、p38、MAPKAPK、HSP27mRNA的表達水平，提示活血益氣方及其拆方可改善缺氧導致的FAK及p38-MAPK信號通路活性的降低，促進細胞骨架重組，提高HUVEC的移行能力進而發(fā)揮促血管新生效應。其中活血益氣方促遷移效應最強，益氣方優(yōu)于活血方，提示在促進遷移的作用方面活血方和益氣方協(xié)同配伍，而益氣藥物發(fā)揮主要作用。前期試驗表明，活血益氣方可以促進HUVEC中VEGF誘導的基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9(參與降解細胞外基質)[17]、一氧化氮(nitric oxide，NO)及內皮型一氧化氮合酶(eNOS，參與VEGF介導的血管滲透性增加)[17]的產(chǎn)生，提示活血益氣方能增加細胞外基質成分和基底膜的降解，通過促進eNOS分泌催化生成NO或直接促進NO的分泌，提高血管通透性，為內皮細胞向血管周圍間隙移行提供有利環(huán)境，這與本研究結果相一致。

綜上所述，活血益氣方及其拆方可提高缺氧后HUVEC的遷移能力，這一作用可能是通過調節(jié)FAK及p38-MAPK信號通路來實現(xiàn)的。結合前期研究基礎，推測活血益氣方及其拆方可對血管新生中細胞機制的多個環(huán)節(jié)進行多靶點的調控，這是其促進缺血心肌血管新生，改善缺血性心臟病的關鍵途徑之一。