白藜蘆醇通過TLR4通路對H9C2細胞高糖缺氧/復氧損傷的作用

近年來，研究發現在心肌缺血再灌注(I/R)時，心肌微血管內皮細胞受損引起活性氧物質的生成，導致細胞因子、炎性組織因子等發生脂質過氧化反應，從而引起心肌組織結構和功能障礙[1]。而糖尿病時，機體也可通過多種機制和信號途徑促進心肌細胞及其間質纖維化，促進心肌重構[2]。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是連接先天性免疫與獲得性免疫的橋梁，Toll 樣受體4 (Toll like receptor 4，TLR4)作為TLRs家族中的一員，已被越來越多的研究證實其在非感染性疾病中具有促進炎癥的作用[3]。

白藜蘆醇(RES)是一種存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的多酚類化合物，研究發現白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化等生物學作用，可抑制由于缺血、缺氧等導致的心肌細胞凋亡，對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用[4-8]。本實驗以H9C2心肌細胞缺氧/復氧損傷及高糖處理為模型，旨在從細胞水平探討白藜蘆醇通過TLR4途徑對缺氧/復氧誘導和高糖后處理心肌細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 H9C2細胞培養 H9C2細胞購置于武漢博士德生物公司，使用DMEM完全培養基(10%FBS和1%雙抗)，37 ℃，5%CO2，高濕度培養箱培養。

1.2 主要儀器和試劑 DMEM低糖培養基(Hyclone，美國)，二氧化碳培養箱(Thermo，美國)，細胞培養皿(Costar，美國)，低溫高速離心機(Thermo，美國)，白藜蘆醇(Sigma，美國)，乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，購自江蘇科特生物科技有限公司，CCK8細胞增殖檢測試劑盒、AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司，兔抗鼠TLR4單克隆抗體、辣根過氧物酶標記的羊抗兔 IgG、 兔抗鼠β-actin 單克隆抗體，購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組和細胞處理 取生長狀態良好的對數生長期細胞，每孔按4×103個接種至96 孔板中，每組設置6個復孔，置于細胞培養箱中培養(37 ℃，5%CO2)，待細胞貼壁后按照分組方案進行相應處理。本研究將細胞分為6組，對照組：心肌細胞按正常培養環境培養，不加任何刺激；缺氧/復氧組：缺氧3 h，復氧2 h，時間開始點為鋪板后48 h；缺氧/復氧+RES組：缺氧3 h，復氧2 h，時間開始點為鋪板后48 h，復氧開始5 min 后加入藥物，一直到2 h；高糖組：高糖濃度為100 mmol/L，處理時間為48 h；高糖+缺氧/復氧組：高糖濃度為100 mmol/L，處理時間為48 h，高糖處理完后，按缺氧/復氧處理，缺氧3 h，復氧2 h；高糖+缺氧/復氧+RES組：高糖濃度為100 mmol/L，處理時間為48 h，按缺氧/復氧處理，缺氧3 h，復氧2 h，白藜蘆醇濃度為25μmol/L，在復氧開始5min 后加入，一直到2 h。

1.3.2 CCK8檢測細胞增殖 將處理過的細胞繼續培養48 h，棄含藥培養基，每孔加入新鮮配制的含10 μL 的毒性檢測液CCK8，將培養板在培養箱孵育3 h，用酶標儀測波長為450 nm 的吸光度。

1.3.3 AnnexinV/PI檢測細胞凋亡率 調整待檢測細胞濃度為106個/mL，取200 μL，1 000 r/min離心5 min(4 ℃)；預冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)1 mL潤洗兩次，1 000 r/min離心5 min(4 ℃)；將細胞重懸于100 μL結合緩沖液，加入2 μL Annexin-V-FITC (20 μg/mL)，輕輕混勻，避光冰上放置15 min；轉至流式檢測管，加入400 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)，每個樣品臨上機前加入1 μL PI (50 μg/mL)，2 min后迅速檢測；同時以不加Annexin V-FITC 及PI 的一管作為陰性對照。

1.3.4 ELISA檢測細胞上清中LDH、MDA和SOD含量 根據ELISA檢測試劑盒說明書測定細胞培養上清中的LDH、MDA 和SOD 含量。

1.3.5 Western-blot法檢測TLR4 表達 收集細胞，RIPA裂解細胞，BCA蛋白定量試劑盒定量，統一濃度至100 μg。每孔上樣20 μg，電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜，加入兔抗鼠TLR4 抗體(1∶500)，4 ℃冰箱孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG(1:5 000) 37 ℃ 孵育1 h，漂洗后于ECL成像系統中發光顯影，拍照。β-actin做內參。

2 結 果

2.1 不同處理對心肌細胞增殖活力的影響 與對照組相比，缺氧/復氧組、高糖組、缺氧/復氧+高糖組CCK8細胞增殖能力明顯下降(P<0.05)，而在加入RES后，缺氧/復氧+RES組、缺氧/復氧+高糖+RES組CCK8細胞增殖能力與缺氧/復氧組、高糖組及缺氧/復氧+高糖組比較有明顯提高(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組CCK8細胞增殖結果(±s)

與對照組比較，1)P<0.05；與缺氧/復氧組、缺氧/復氧+高糖組比較，2)P<0.05

2.2 不同處理對心肌細胞凋亡的影響 與對照組比較，缺氧/復氧組、缺氧/復氧+高糖組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。加入白藜蘆醇后，缺氧/復氧+RES組、缺氧/復氧+高糖+RES組細胞凋亡率較缺氧/復氧組、缺氧/復氧+高糖組明顯下降(P<0.05)。高糖組細胞凋亡率與對照組比較有所升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組細胞凋亡、LDH、MDA和SOD比較(±s)

與對照組比較，1)P<0.05；與缺氧/復氧組、缺氧/復氧+高糖組比較，2)P<0.05

2.3 各種處理對上清中LDH、MDA和SOD含量的影響 缺氧/復氧組、高糖組、缺氧/復氧+高糖組與對照組比較，LDH、MDA均明顯升高(P<0.05)，SOD明顯下降(P<0.05)；RES處理后，缺氧/復氧+RES組、缺氧/復氧+高糖+RES組LDH、MDA均較缺氧/復氧組、缺氧/復氧+高糖組明顯下降(P<0.05)，SOD較缺氧/復氧組、缺氧/復氧+高糖組明顯升高(P<0.05)。詳見表2。

2.4 TLR4蛋白的表達(見圖1) 缺氧/復氧組、高糖組及缺氧/復氧+高糖組心肌細胞的TLR4蛋白表達量較對照組明顯升高，而經過RES處理后，缺氧/復氧+RES組、缺氧/復氧+高糖+RES組TLR4蛋白表達量較缺氧/復氧組及缺氧/復氧+高糖組有所降低，但差異無統計學意義。

A：對照組；B：缺氧/復氧組；C：缺氧/復氧+RES組；D：高糖組；E：缺氧/復氧+高糖組；F：缺氧/復氧+高糖+RES組

圖1各組TLR4蛋白的表達

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷是心肌在缺血基礎上恢復血流再灌注后，引起細胞功能代謝障礙和結構損傷的現象。糖尿病是一種以高血糖為特征的慢性代謝性疾病。代謝紊亂、心肌纖維化、心肌細胞凋亡、微血管病變、氧化應激、炎癥反應、線粒體結構功能改變等都參與糖尿病心肌病的發生發展過程[9]。MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，具有細胞毒作用，可加劇細胞膜的損傷。LDH存在于心肌細胞的胞漿中，是反映細胞損傷的重要標志物之一。SOD是機體內天然存在的超氧自由基清除因子。本研究結果顯示，與對照組相比，缺氧/復氧組及缺氧/復氧+高糖組LDH、MDA及細胞凋亡率升高，SOD降低，心肌細胞增殖受到抑制；高糖組細胞凋亡率無明顯變化，LDH、MDA明顯升高，SOD明顯降低，心肌細胞增殖受到抑制。實驗證明，心肌缺血再灌注可通過氧化應激反應促進心肌細胞凋亡、抑制心肌細胞增殖，而高糖處理通過氧化應激反應明顯抑制心肌細胞增殖，但心肌細胞凋亡不明顯。考慮高糖誘導心肌細胞損傷是一種慢性過程，心肌細胞損傷的程度及機制可能與高糖處理的濃度及時間有關。

越來越多的研究表明，炎癥反應在心血管疾病的發生發展中起重要作用[10]。而 TLRs能促進細胞因子的合成與釋放，引發炎癥反應[11]。TLR4是TLRs 家族的一員，其在識別脂多糖及介導的炎癥反應信號轉導中發揮了重要作用。TLR4 在部分心血管疾病發生發展過程中起到的作用也成了當前的研究熱點。有文獻報道心臟TLR4的轉錄或翻譯水平在壓力超負荷或高血壓所致心臟重構[12]，缺血再灌注或心肌梗死后心臟重構[13]以及糖尿病心臟重構時增多[14]。本研究結果顯示，缺氧/復氧處理組和高糖處理組與對照組相比TLR4表達均明顯升高，證實了TLR4通路可能參與了糖尿病心肌細胞缺血再灌注的損傷過程。

白藜蘆醇具有抗氧化、螯合自由基及抗脂質過氧化等生理藥理學作用，能預防及治療心臟病、動脈粥樣硬化、神經退行性疾病。有研究表明，白藜蘆醇對缺氧/復氧心肌細胞有保護作用[7-8]。另有研究表明，白藜蘆醇可通過負向調控TLR4信號通路減輕高糖環境下牙齦上皮細胞炎癥因子的分泌[15]。本研究結果顯示，白藜蘆醇處理組與缺氧/復氧和高糖處理組相比，TLR4表達有一定程度下降，但作用有限。其原因可能與白藜蘆醇處理的濃度和時間有關。另外推測TLR4信號通路也可能只是RES對糖尿病心肌細胞缺血再灌注損傷保護作用的機制之一。

總之，缺氧/復氧和高糖均可通過TLR4表達增加在不同程度上促進心肌細胞的氧化應激及炎癥反應，從而加速心肌細胞凋亡，抑制心肌細胞增殖。這一作用可能參與了心肌缺血再灌注損傷和糖尿病心肌病的發病機制。白藜蘆醇可能通過降低TLR4表達對糖尿病心肌細胞缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，但具體應用的濃度及時間尚待進一步探討。