急性心肌梗死病人外周血單個核細胞中miR-146a表達及與短期預后的關系探討

趙 鵬，張彥周2，吳磊明2，李愛琴，索森森

急性心肌梗死作為是冠心病的嚴重類型，具有較高的致殘率、致死率，是導致死亡的主要因素[1]，嚴重威脅病人生命健康。研究表明，早期診斷及評估病人病情對改善預后具有重要意義[2]。微小RNA(micro RNA，miRNA)作為廣泛存在于生物體內高度保守的短鏈RNA，在機體多項生理過程中發揮重要作用，與多種疾病發生及進展密切相關，且其具有細胞和組織特異性，可穩定存在于血液中而不被降解，已成為多種疾病的診斷指標[3]。miR-146a作為重要的miRNA類型，在調控固有免疫及炎癥反應中發揮重要作用[4]，而炎癥反應在加速血栓形成引發心肌心肌梗死中發揮重要作用[5]。本研究擬分析急性心肌梗死病人外周血單個核細胞中miR-146a表達，探討其與該病的相關性及在預后評估中的意義，以期為臨床實踐提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年2月—2016年8月在河南焦作市人民醫院心內科治療的急性心肌梗死病人155例作為病例組，其中男88例，女67例，年齡41～77(61.58±9.02)歲，納入標準：①符合國際心臟病學會及世界衛生組織(WHO)制定的關于急性心肌梗死診斷標準；②發病至入院時間在12 h內；③經心電圖、心肌酶及冠狀動脈造影等檢查確診。排除標準：①肝、腎等重要臟器嚴重功能障礙者；②合并心功能不全、嚴重心律失常、心源性休克者；③惡性腫瘤、神經運動系統疾病、血液系統疾病、免疫系統疾病、急慢性炎癥者；④近半年接受過手術治療者以及臨床資料不全者。同期在我院體檢中心選取健康者60名作為對照組，其中男37名，女23名，年齡40～78(61.02±8.42)歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究通過醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集所有研究對象性別、年齡、身高、體重、吸煙情況、血壓、血脂[總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)]等一般資料，計算體質指數(BMI)，記錄急性心肌梗死病人抗凝、降脂、降壓藥物使用情況以及左心室射血分數(LVEF)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、B型鈉尿肽(BNP)等檢測結果。

1.2.2 標本采集和處理 急性心肌梗死病人于就診24 h、對照組于體檢當日分別抽取空腹肘靜脈血6 mL，置于乙二膠四乙酸抗凝管內，根據人淋巴細胞分離液(購自北京達科生物技術公司)操作說明對單個核細胞進行分離，并統計細胞數。

1.2.3 利用實時熒光定量PCR技術檢測單個核細胞中miR-146a表達 取單個核細胞，加入細胞裂解液，按Trizol總RNA提取試劑盒(購自美國Invitrogen公司)說明提取總RNA，使用紫外分光光度計(購自德國Eppendorf公司)檢測總RNA純度，以A260/A280在1.80～2.20為合格，-80 ℃冰箱保存備用。根據逆轉錄試劑盒(購自德國Qiagen公司)說明將總RNA合成cDNA，反應條件：40 ℃ 50 min，94 ℃ 5 min，4 ℃ 20 min。根據PCR擴增試劑盒(購自德國Qiagen公司)說明對引物序列配比后在實時熒光定量PCR儀(購自美國ABI公司)上擴增。引物序列：miR-146a，上游5′-ATTTTACAGGGCTGGGACAG-3′，下游5′-TCTTCCAAGCTCTTCAGCAG-3′；U6，上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。PCR反應條件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，76 ℃ 30 s，連續循環38次。每個樣品設6個平行復孔。用2-△△Ct法計算單個核細胞中miR-146a相對表達量。

1.2.4 病例隨訪 所有病人順利出院，且均進行門診或電話隨訪12個月，記錄主要不良心血管事件(MACE)發生情況，包括急性冠狀動脈事件、心律失常、新發心力衰竭或原有心力衰竭加重、心絞痛、心源性休克或死亡等。MACE評估由心內科具有副主任醫師職稱以上的兩位醫師完成評定。將病人分為MACE組和非MACE組。

2 結 果

2.1 病例組和對照組一般資料及外周血中miR-146a表達比較 病例組和對照組性別、年齡、BMI、吸煙、收縮壓、舒張壓、TC、TG、HDL-C和LDL-C差異無統計學意義(P>0.05)，病例組外周血單個核細胞中miR-146a相對表達量高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 病例組和對照組一般資料及外周血中miR-146a表達比較

注：1 mmHg=0.133 kPa

2.2 外周血中miR-146a表達在診斷急性心肌梗死時的價值 ROC曲線分析結果顯示，外周血單個核細胞中miR-146a相對表達量在診斷急性心肌梗死時，曲線下面積0.964(95%CI0.942～0.986)，當miR-146a相對表達量取界值1.65時，靈敏度為91.6%，特異度為91.7%。詳見圖1。

2.3 MACE組和非MACE組一般資料和外周血中miR-146a表達 隨訪12個月時，病例組發生MACE46例(29.68%)。兩組病人在性別、年齡、BMI、吸煙比例、TC、TG、HDL-C、LDL-C、阿司匹林使用比例、他汀類使用比例、氯吡格雷使用比例和ACEI/ARB使用比例方面差異無統計學意義(P>0.05)；MACE組糖尿病比例、cTnI、BNP和miR-146a表達量高于非MACE組，而高血壓比例、血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)/血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)使用比例、β受體阻滯劑使用比例、LVEF低于非MACE組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

圖1 外周血中miR-146a表達在診斷急性心肌梗死時的ROC曲線

表2 MACE組和非MACE組病人一般資料和外周血中miR-146a表達比較

2.4 急性心肌梗死病人預后影響因素分析 以是否發生MACE為因變量，以單因素分析P<0.10的變量為自變量進行多因素Logistic回歸分析，對變量進行調整后，結果顯示，cTnI、BNP和miR-146a表達量是影響急性心肌梗死病人預后的獨立危險因素(P<0.05)。詳見表3。

表3 急性心肌梗死病人預后影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.5 外周血單個核細胞中miR-146a表達在評估病人預后時的價值 ROC曲線分析結果顯示，外周血單個核細胞中miR-146a相對表達量在評估病人預后時，曲線下面積0.873(95%CI0.800～0.946)，當miR-146a相對表達量取界值1.83時，靈敏度為76.1%，特異度為90.8%。詳見圖2。

圖2 外周血單個核細胞中miR-146a表達在評估病人預后時的ROC曲線

3 討 論

急性心肌梗死作為臨床上常見的危重癥，起病急、進展快、癥狀重、致死率高[6]。研究表明，急性心肌梗死治療的關鍵在于盡早恢復血流重建，心肌缺血時間>12 h，則會出現不可逆性損傷而增加病人死亡風險[7]。但由于部分病人早期癥狀不明顯，且約有50%的病人發病后心電圖表現無特異性[8]，因此，積極尋找急性心肌梗死早期診斷及病情或預后評估的生物學標志物已成為臨床重點。有研究指出，循環miRNA穩定存在于血液中，且某些miRNA可特異性存在于心肌中[9]，為尋找急性心肌梗死診斷生物標志物及發病機制研究提供了新方向和思路。有研究指出，冠心病病人血漿miR-126表達異常，急性心肌梗死病人中表達下降，可能是病人診斷的新型標志物[10]。miR-146a作為與自身免疫功能及炎癥反應密切相關的miRNA，在自身免疫性疾病和炎癥反應相關疾病發生及進展中發揮重要作用[11]，研究表明，miR-146a可能通過調控炎癥反應而與動脈粥樣硬化斑塊穩定性關系密切[12]。本研究結果顯示，急性心肌梗死病人外周血單個核細胞中miR-146a相對表達量高于對照組，而其他臨床指標則與對照組比較差異無統計學意義，說明miR-146a在急性心肌梗死病人外周血單個核細胞中呈高表達，可能參與了急性心肌梗死發病過程。ROC曲線分析結果顯示，外周血單個核細胞中miR-146a相對表達量對急性心肌梗死診斷的最佳界值為1.65時，曲線下面積0.964，靈敏度91.6%，特異度91.7%，說明miR-146a對急性心肌梗死具有一定的診斷價值，當外周血單個核細胞中miR-146a相對表達量高于1.65時應考慮急性心肌梗死的可能。

本研究對急性心肌梗死病人隨訪12個月，發現46例發生了MACE，發生率29.68%，與以往研究報道結果[13-14]無差異。cTnI是目前臨床上常用的早期診斷急性心肌梗死的“金標準”[15]，BNP是近年來研究熱點，可作為急性心肌梗死診斷及預后評判的指標[16]，本研究在發現，MACE病人外周血單個核細胞中miR-146a呈高表達，且血清cTnI和BNP高于非MACE組，說明miR-146a低表達可能與MACE發生有關。多因素Logistic回歸分析結果顯示，cTnI、BNP和miR-146a表達量是影響急性心肌梗死病人預后的獨立危險因素，說明miR-146a低表達是急性心肌梗死病人預后不佳的獨立危險因素，ROC曲線分析進一步發現，外周血單個核細胞中miR-146a相對表達量取界值1.83時，在評估病人預后時，曲線下面積0.873，靈敏度76.1%，特異度90.8%，說明miR-146a表達對急性心肌梗死病人預后具有一定預測價值，可作為評估病人預后的指標。

綜上所述，急性心肌梗死病人外周血單個核細胞中miR-146a呈高表達，且與病人不良預后有關，有望成為急性心肌梗死病人診斷及預后評估的潛在標志物。