RNA干擾高遷移率族蛋白1對Aβ25-35刺激HT22細胞中晚期糖基化終末產物受體/Toll樣受體4信號通路相關蛋白表達的影響

韓 園，劉 煜，戈文威，王孝慶，曹 紅，李 軍

（溫州醫科大學附屬第二醫院，育英兒童醫院麻醉與圍術期醫學科，浙江 溫州325027）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種多發的病因未明的中樞神經系統退行性疾病，主要表現為記憶力減退，認知功能障礙以及性格改變，嚴重影響患者正常生活和基本工作[1]。目前公認主流學說“β 淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）級聯瀑布假說”，是指腦內沉積的Aβ主要由淀粉樣前體蛋白（amyloid-β precursor protein，APP）經過β 分泌酶Ⅰ和γ 分泌酶1 和酶2 所合成，然后又通過腦啡肽酶（neprilysin，NEP）等方式降解。AD 患者腦內Aβ的形成和清除的不平衡導致過量的Aβ產生級聯作用，可通過炎癥反應、氧化應激、糖氧剝離、細胞凋亡、線粒體功能障礙等多種途徑加速AD 的病程。AD 患者腦內的Aβ 激活了神經元細胞和小膠質細胞，繼而釋放大量的炎癥因子，通過氧化還原反應對神經元以及突觸造成傷害[2]。高遷移率族蛋白box-1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）是一種非組DNA結合蛋白，不僅參與DNA的轉錄，且在神經元細胞和小膠質細胞上廣泛表達，參與腦中神經炎癥的進程，其受體主要有晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）和TLR4等[3]。近年來研究表明，靶向特異性抑制HMGB1對于慢性炎癥反應和自身免疫性疾病等的治療有一定作用[4]，而小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默HMGB1 表達，可減少Aβ25-35刺激下原代海馬神經元細胞中HMGB1 的表達，其機制可能與RAGE/TLR4信號通路相關[5]，故本研究探討siRNA抑制HMGB1的表達對Aβ25-35刺激HT22的影響，進一步研究HMGB1在AD病理機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

Aβ25-35（A4559）和MTT（M5655）購自美國Sigma公司；DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；脂質體轉染試劑GenMute（SL100568）購自美國Signagen公司；兔抗小鼠HMGB1多克隆抗體（ab18256）、兔抗小鼠RAGE多克隆抗體（ab3611）、兔抗小鼠NF-κB P65 單克隆抗體（ab7970）購自英國Abcam 公司；小鼠抗小鼠TLR4 單克隆抗體（sc-293072）購自美國Santa公司；兔抗小鼠β肌動蛋白多克隆抗體（ap0060）購自美國Bioworld公司；小鼠IL-1β 和TNF-α ELISA 檢測試劑盒購自美國R&D 公司；DyLight-594 驢抗兔（E032421）購自美國Earthox 公司，HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗（BYE003）和HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 二抗（BYE004）購自美國Jackson 公司（上海博蘊生物科技有限公司分裝）。

1.2 細胞培養

HT22 細胞購自ATCC 細胞庫，該細胞是小鼠海馬細胞來源的HT-4 細胞系的一個亞系[6]。將HT22細胞接種于DMEM完全培養基（含1%青鏈霉素、10%胎牛血清），置于37°С，5%CO2恒溫培養箱中培養。

1.3 MTT法測Aβ25-35細胞存活

對數生長期的HT22 細胞經胰酶消化，按5×107L-1的密度接種于96孔板。16 h后，細胞鋪滿孔底，吸去孔內培養液，各組加入不同濃度的Aβ25-35（0，2.5，5，10，20和40 μmol·L-1），每組設3個復孔，孵育24 h 后，加入20 μL MTT 溶液，繼 續培養4 h 后，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解。用酶標儀測定在490 nm處的吸光度A490nm，并計算細胞存活率，實驗重復3 次。細胞存活率（%）=（處理組A490nm-空白組A490nm）/（對照組A490nm-空白組A490nm）×100%。計算得出其半抑制濃度（IC50）

1.4 HMGB1 siRNA序列的篩選

根據siRNA 的設計原則和GenBank 中的HMGB1 的基因序列，設計出具有特異性的針對HMGB1 的4 個大小為21 個核苷酸的干擾序列（siRNA551，siRNA706，siRNA773 和siRNA821），以及與HMGB1 序列無同源性的陰性對照片段（scramble siRNA）。siRNA 序列委托上海吉瑪公司合成：siRNA551：5′-CAAGGCUCGUUAUGAAAGATT-3′（正義鏈），5′-UCUUUCAUAACGAGCCUUGTT-3′（反義鏈）；siRNA706：5′-GCUUAUCCAUUGGUGAUGUTT-3′（正 義 鏈），5′-ACAUCACCAAUGGAUAAGCTT-3′（反義鏈）；siRNA773：5′-GCAGCCCUAUGAGAAGAAATT-3′（正義鏈），5′-UUUCUUCUCAUAGGGCUGCTT-3′（反義鏈）；siRNA821：5′-GGAUAUUGCUGCCUACAGATT-3′（正義鏈），5′-UCUGUAGGCAGCAAUAUCCTT-3′（反義鏈）。

選取對數生長期的細胞，用0.25%胰酶消化后，加入含10%胎牛血清的DMEM，調整細胞濃度為1×108L-1，接種至6孔板中，待細胞生長達50%～60%融合度時進行轉染，轉染按GenMute轉染試劑說明書操作。轉染24 h 后收集細胞進行Western印跡檢測。

1.5 免疫熒光法觀察HMGB1的定位

取對數生長期的HT22 細胞，接種于帶有細胞爬片的6孔板上，16 h后加入Aβ25-35處理24 h，經多聚甲醛固定，Triton X-100 通透，山羊血清封閉，加一抗（兔抗小鼠HMGB1 多克隆抗體，1∶1000）和熒光標記二抗（DyLight-594 驢抗兔，1∶50），以及4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復染核，最后在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.6 Western印跡法檢測HMGB1，RAGE，TLR4和NF-κB P65蛋白量表達

將對數生長期的HT22 細胞分為5 組：正常細胞對照組（按常規方法培養不做任何處理），Aβ25-35組（加入終濃度為40 μmol·L-1的Aβ25-35，處理24 h）；siRNA 組（轉染siRNA 50 μmol·L-1，作用24 h）；siRNA 或scramble siRNA+Aβ25-35組（轉染siRNA或scramble siRNA 50 μmol·L-1作用24 h后，加入終濃度為40 μmol·L-1的Aβ25-35繼續孵育24 h）。

收集細胞，提取細胞蛋白，BCA 法測定蛋白質濃度，經制膠、上樣（10 μL體積含30 μg蛋白樣品）、電泳、轉膜、封閉、孵育一抗（HMGB1，1∶1000；RAGE，1∶1000；TLR4，1∶500；NF-κB P65，1∶2000和β肌動蛋白，1∶1000）及二抗（HRP標記的山羊抗兔IgG 二抗，1∶5000；HRP 標記的山羊抗小鼠IgG二抗，1∶5000）后曝光，用Quantity One軟件對蛋白HMGB1，RAGE，TLR4，NF-κB P65 和β 肌動蛋白進行積分吸光度（integrated absorbance，IA）分析。待測蛋白相對表達水平用IA目標蛋白/IAβ肌動蛋白比值表示。

1.7 ELlSA法檢測細胞上清液中lL-1β和TNF-α的水平

收集正常細胞對照組（不做任何處理）、Aβ25-35組（加入終濃度為40 μmol·L-1的Aβ25-35，處理24 h）、siRNA+Aβ25-35組（轉染siRNA 50 μmol·L-1作用24 h后，加入終濃度為40 μmol·L-1的Aβ25-35繼續孵育24 h）各組細胞上清液，按ELISA 試劑盒說明書操作，用酶標儀測定標準品及樣本吸光度值，根據標準品的濃度和吸光度繪制標準曲線，計算樣本IL-1β和TNF-α水平。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 Aβ25-35作用HT22細胞24 h時lC50

MTT 結果顯示（圖1），Aβ25-350，2.5，5，10，20和40 μmol·L-1作用HT22 細胞24 h 后，HT22 細胞的存活率隨著Aβ25-35濃度增加而下降，IC50為41.17 μmol·L-1，為此本研究采用Aβ25-3540 μmol·L-1進行后續實驗。

2.2 Aβ25-35對HT22細胞形態的影響

顯微鏡觀察細胞形態結果（圖2）顯示，正常組HT22 細胞形態良好，胞體豐滿，突起細長明顯，突起間連接緊密；Aβ25-3540 μmol·L-1作用24 h 后，細胞大量死亡，聚集成團，突起減少，細胞間隙增大（箭頭所示）。

2.3 Aβ25-35引起HT22細胞中HMGB1的定位改變

免疫熒光觀察結果（圖3）顯示，藍色熒光代表DAPI染色陽性的細胞核，紅色熒光代表HMGB1染色陽性的細胞，在正常對照組，紅色熒光與藍色熒光重合，說明HMGB1定位在核內；經Aβ25-3540 μmol·L-1作用24 h 后，紅色熒光分布于藍色熒光周圍，說明HMGB1從核內逐漸釋放至核外（見箭頭所示）。

Fig.3 Effect of Aβ25-35 on location of high mobility group box-1 protein (HMGB1) in HT22 cells by immunofluorescence staining. Red colour represents HMGB1-positive cells；blue colour represents DAPI-positive cells. HT22 cells were stimulated by Aβ25- 35 40 μmol·L- 1 for 24 h. Arrows show location changes of HMGB1.

2.4 siRNA對HMGB1表達的抑制

Western印跡結果（圖4）顯示，與正常對照組相比，siRNA551，siRNA706，siRNA773和siRNA821組細胞中HMGB1 蛋白表達均顯著降低（P＜0.05）；提示4條特異性的siRNA序列均抑制HMGB1蛋白的表達，siRNA821抑制率最高，故選擇其用于后續實驗。

2.5 沉默HMGB1 對Aβ25-35誘導的HMGB1，RAGE，TLR4 和NF-κB P65表達的影響

Fig.4 lnhibitory effect of four kinds of small interfering RNAs (siRNAs) on expression of HMGB1 protein by Western blotting. HT22 cells were transfected by siRNA551，siRNA706，siRNA773 and siRNA821 or scramble siRNA at concen-50 μmol·L-1 for 24 h. B was the semi-quantitative result of A.s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with scramble siRNA group.

Fig.5 Effect of HMGB1 inhibited by siRNA821 on expressions of HMGB1，receptor for advanced glycation end products（RAGE），Toll-like receptor 4（TLR4）and NF-κB P65 in HT22 cells induced by Aβ25-35 by Western blotting.HT22 cells were transfeced with siRNA821 or scramble siRNA at concentration of 50 μmol·L-1 for 48 h and induced by Aβ25-35 40 μmol·L- 1 for 24 h. B was the semi-quantitative result of A.s，n=3. ＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with Aβ23-35 40 μmol·L-1 group；ΔP＜0.05，compared with siRNA821+Aβ25-35 group.

Western 印跡結果（圖5）顯示，與正常對照組相比，Aβ25-3540 μmol·L-1組HMGB1，RAGE，TLR4和NF-κB P65 的表達均升高（P＜0.05），siRNA821組以上各蛋白表達均下降（P＜0.05），提示siRNA821沉默HMGB1 對以上各蛋白的表達有抑制作用；與Aβ25-3540 μmol·L-1組相比，siRNA+Aβ25-35組HMGB1，RAGE，TLR4和NF-κB P65的表達均降低（P＜0.05），而scramble siRNA+Aβ25-35組各蛋白表達無明顯變化，提示siRNA821沉默HMGB1可特異抑制Aβ25-35誘導的各蛋白表達的增高（P＜0.05）。

2.6 沉默HMGB1 對Aβ25-35誘導的HT22 細胞分泌lL-1β和TNF-α含量的影響

ELISA 結果（圖6）顯示，與正常對照組相比，Aβ25-3540 μmol·L-1處理HT22 細胞24 h 后，Aβ25-3540 μmol·L-1組上清液中IL-1β和TNF-α含量明顯升高（P＜0.05）；與Aβ25-3540 μmol·L-1組相比，Aβ25-35+siRNA 組上清液中IL-1β 和TNF-α 水平明顯下降（P＜0.05），提示siRNA821沉默HMGB1表達后，可抑制HT22細胞IL-1β和TNF-α的表達。

Fig.6 Effect of HMGB1 inhibited by siRNA821 on levels of interleukin-1β（lL-1β）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）in culture supernatants of HT22 cells induced by Aβ25-35 by ELlSA. See Fig.5 for the cell treatment.s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with Aβ23-35 group.

3 討論

海馬區作為大腦邊緣系統的主要組成部分，參與機體學習、記憶和整合處理外界信號等重要生理過程。動物實驗雖能模擬AD 的發病過程，但因實驗受多因素影響，故本研究采用HT22 細胞。該細胞來源于小鼠的海馬神經元，因具有可長期連續傳代、增殖速度快、均一性好、經濟快速便捷、易于轉染等優勢，常被神經科學研究用于與海馬相關的記憶形成和認知障礙方面的分子機制的研究[7]。人工合成Aβ25-35是具有神經毒性的氨基酸片段，故經常被用來建立AD 模型[8]。本研究中，Aβ25-35在40 μmol·L-1時刺激小鼠HT22 細胞，出現細胞活力下降，且細胞形態發生改變，軸突樹突變短，胞體間連接減少，繼而出現細胞死亡。這模擬了AD 患者腦內海馬細胞的病理生理過程，可以作為有效的AD離體模型用于本研究。

本研究采用免疫熒光雙標的方法觀察到，Aβ25-35刺激HT22 細胞后，HMGB1 從核內轉移到核外。HMGB1 主要存在于細胞核內，參與維持DNA穩定，修復損傷DNA，在DNA的轉錄調控與自我復制等過程中起著十分重要的作用，此外HMGB1 還是啟動和維持炎癥級聯反應的關鍵分子，與中樞神經系統炎癥反應密切相關。臨床研究發現，AD 患者的顳葉皮質中，HMGB1 的表達水平升高[9]，腦室內聯合注射HMGB1和Aβ加劇AD動物模型腦內神經元的死亡并延遲Aβ 從腦中的清除[10]。此外，HMGB1 還與Aβ 形成復合體，穩定Aβ 的低聚體狀態，抑制小膠質細胞對于Aβ的吞噬作用[9]。這可能是海馬細胞通過HMGB1 核轉位實現自我修復的“保護”作用。

本研究發現，Aβ25-35刺激HT22 細胞后，細胞上清液中IL-1β 和TNF-α 水平升高，細胞中HMGB1，RAGE，TLR4 和NF-κB P65 等蛋白的表達均升高。HMGB1 的下游受體主要是RAGE 和TLR 成員，包括TLR2和TLR4。RAGE在神經元及膠質細胞表面均有表達，Aβ 與RAGE 結合后可促進Aβ 由胞外向胞內的轉運，加快Aβ 在腦內的沉積，而HMGB1 與RAGE 結 合 后，下 游P38 和ERK 被 激活，繼而激活NF-κB，從而導致NF-κB 相關促炎基因的表達上調[11]。而HMGB1 和TLR4 結合后，通過MyD88 依賴性途徑進而促使NF-κB 活化，導致大量炎癥因子釋放[12]。故推測Aβ 可能是通過HMGB1激活了下游NF-κB通路，分子機制見圖7。

Fig.7 Aβ triggers nuclear HMGB1 release that can contribute to neuroinflammation via HMGB1-RAGE/TLR4-NF-κB signaling pathway.

RNA 干擾技術（RNA interference，RNAi）已逐漸用于疾病的基因治療，并已取得初步效果，RNAi利用具有同源性的雙鏈RNA 誘導特異序列的目標基因沉寂，迅速降低基因活性[13]。本研究發現，給予siRNA 沉默HMGB1 表達，可減少Aβ25-35刺激下HT22 細胞內HMGB1 表達的升高，同時也減少了下游RAGE，TLR4和NF-κB P65的表達，并降低了細胞上清液中IL-1β和TNF-α的水平。本課題組前期實驗證實，RNA 干擾HMGB1 表達可減少Aβ25-35刺激下BV-2細胞內NF-κB的表達[14]。這與本團隊近期的研究結果[5]一致。該研究采用的原代海馬細胞取自胎鼠海馬組織，盡管原代細胞更能反映體內環境，但培養困難、不易增殖、不易轉染，且極易污染。

本研究將治療策略的重點集中在基因水平上，并大膽地鎖定在HMGB1這個位點上。這與前期其他學者研究的蛋白水平方向是一致的。Fujita等[15]研究表明，在AD 大鼠模型上，給予HMGB1 特異性拮抗劑能夠抑制神經元退化以及淀粉樣沉淀Aβ 形成，有益于改善大鼠的認知功能。Wang 等[16]研究發現，在糖尿病大鼠缺血再灌注損傷模型上，ip給予HMGB1 拮抗劑能夠逆轉炎癥反應以及腦損傷程度。特異性抑制HMGB1 表達在改善神經炎癥、改善認知功能方面具有一定保護作用。近年來，抗HMGB1中和抗體、重組A-box蛋白、丙酮酸乙醋和甘草酸苷等天然或合成的小分子HMGB1抑制劑用于HMGB1相關機制疾病的研究得到了越來越多的關注[4]，這些研究是在蛋白水平抑制HMGB1 的表達，而本研究將治療策略的重點集中在基因水平上。

綜上所述，通過RNA 沉默HMGB1 的表達，可以降低Aβ25-35刺激下HT22 細胞內炎性蛋白的表達和炎性因子的分泌。可見HMGB1 在AD 發生發展過程中具有重要作用，HMGB1-TLR/RAGE-NF-κB炎癥信號通路在AD 模型中具有重要地位。HMGB1有可能成為AD診斷中的一個重要的生物標志物以及AD基因治療潛在的生物靶點，為AD的治療提供一種新的思路。然而，將RNAi技術運用到動物模型和人體試驗中，仍需要進一步研究和探索。