丙戊酸對乳腺癌MCF7細胞的放射增敏性依賴于抑癌基因p53

田竹筠，楊春旺，蔡祖超，鳳志慧

（1.山東大學公共衛生學院，山東濟南250012；2.濟南市第三人民醫院，山東濟南250132）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。據世界衛生組織統計，我國乳腺癌發病率和死亡率雖均低于世界平均水平，但近年來乳腺癌的發病率呈迅速增長趨勢，因此，如何有效治療乳腺癌備受關注。電離輻射（ionizing radiation，IR），即放射治療是臨床上常用的乳腺癌治療手段，尋找有效地增強放射治療效果的增敏劑是該領域研究的焦點問題。IR 能導致嚴重的DNA 損傷，即誘發DNA 雙鏈斷裂。在DNA 雙鏈斷裂修復機制中，同源重組（homologous recombination，HR）修復發揮了重要作用。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）能調控細胞周期中DNA修復和檢查點激活，使該基因與HR修復機制緊密相關[1-3]。重組酶51（recombinase 51，Rad51）是HR 修復機制的關鍵蛋白，在參與DNA 雙鏈斷裂損傷的HR修復中發揮重要作用。丙戊酸（valproic acid，VPA）是一種短鏈脂肪酸，具有抗腫瘤活性[4]，本課題組和其他研究小組均發現，VPA在治療癲癇病的血藥劑量（0.3～0.8 mmol·L-1）條件下能夠抑制腫瘤細胞的生長并具有放射增敏作用[2，5-7]。本課題組研究還發現，VPA 0.5 mmol·L-1可通過干擾BRCA1-Rad51介導的HR 修復機制，增加乳腺癌細胞的放射敏感性[2]。各種不同類型的癌癥中約50%會發現抑癌基因野生型p53（wild-type p53，wtp53）存在基因變異。p53在細胞凋亡、細胞周期調控、基因組的穩定性、腫瘤發生和DNA損傷修復等一系列的細胞活動中均發揮重要作用。本課題組研究表明，抑癌基因p53 具有抑制HR修復過度增強的作用，以維持HR功能處于正常水平[8]。在結直腸癌細胞中，p53通過干擾細胞凋亡機制影響VPA的放射增敏作用，表現為VPA的放射增敏作用在wtp53細胞中尤為顯著；而對于p53缺欠（defective p53，dp53）的細胞，其放射增敏作用受到抑制[9]。本研究旨在探討在人乳腺癌MCF7細胞中，對于dp53細胞，VPA 的放射增敏作用是否受影響及其作用機制與HR修復功能之間的關系，為VPA用于臨床治療乳腺癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

人乳腺癌細胞MCF7（美國ATCC公司）。VPA、PLKO1、p53 shRNA慢病毒顆粒和甲紫（結晶紫）（美國Sigma公司）；pDR-GFP質粒（Maria Jasin，Memorial Sloan Kattering Cancer 饋贈）；彗星實驗試劑盒（美國Invitrogen 公司）；DAPI 染液（美國Gene Copoeia 公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo Fisher公司）；小鼠抗兔P53、β肌動蛋白和磷酸化組蛋白（phosphorylated histone，γH2AX）抗體（一抗）（美國Millipore公司）；小鼠抗兔BRCA1抗體和兔抗小鼠Rad51 抗體（一抗）（美國Santa Cruz 公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體（二抗）（美國Thermo Fisher 公司）；ALexarFlour488熒光標記雞抗兔IgG抗體和ALexarFlour594 熒光標記山羊抗小鼠IgG 抗體（二抗）（美國Molecular Probe 公司）。Primus S型醫用直線加速器（德國西門子公司）；IX70型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；FACS AriaⅢ型流式細胞儀（美國碧迪醫療公司）；5430R Eppendorf 離心機（美國Eppendorf公司）。

1.2 細胞系的建立

用含PLKO.1 或p53 shRNA 慢病毒顆粒液感染MCF7 細胞，建立p53 表達下調的同源配對MCF7 細 胞（MCF7/wtp53 和MCF7/dp53）[8]；向MCF7 細胞中轉染pDR-GFP，篩選穩定表達pDRGFP 的MCF7/pDR-GFP 細 胞；用 含PLKO.1 或p53 shRNA 慢病毒顆粒液分別感染MCF7/pDRGFP 細胞，建立MCF7/pDR-GFP/wtp53 和MCF7/pDR-GFP/dp53細胞[7，9]。

1.3 Western印跡法檢測P53蛋白表達

取生長狀態良好的MCF7 細胞、MCF7/wtp53和MCF7/dp53細胞，按照每皿細胞總數3×106接種于p100培養皿中。培養24 h，消化離心后，提取細胞內總蛋白，按BCA試劑盒操作要求測定蛋白質濃度，將樣品蛋白質濃度調配一致，取總蛋白60 μg上樣，按照常規處理方法進行電泳[2]。經電泳分離后轉印至PVDF 膜上，6%脫脂奶粉封閉1 h，加入抗P53（1∶300）或β肌動蛋白（1∶1000）抗體后置搖床4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG 二抗室溫孵育1 h，加ECL 發光液暗室顯影，掃描分析蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA），以P53 蛋白與β 肌動蛋白IA比值表示P53蛋白表達水平。

1.4 中性彗星實驗檢測DNA雙鏈斷裂損傷

取生長狀態良好的MCF7/wtp53 和MCF7/dp53細胞，制成單細胞懸液，按照每皿細胞總數2×105接種于不同p35培養皿，MCF7/wtp53和MCF7/dp53 細胞各分為4 組：細胞對照組、VPA 組（VPA 0.5 mmol·L-1處理24 h）、IR組（IR 8 Gy）和VPA+IR組（VPA 0.5 mmol·L-1預處理24 h后，IR 8 Gy）。IR處理后恢復30 min，按照常規處理方法進行中性彗星實驗[10]，Cometscore 軟件分析細胞核拖尾情況。細胞核拖尾尾距越長，表明DNA雙鏈斷裂損傷越嚴重。雙鏈斷裂損傷程度（%）=彗星拖尾長度/細胞對照組彗星拖尾長度值×100%。

1.5 免疫熒光實驗檢測DNA 損傷標志物γH2AX、HR修復蛋白Rad51和BRCA1的焦點形成

取生長狀態良好MCF7/wtp53 和MCF7/dp53細胞，按照每孔細胞總數2×104個接種于8 孔載玻片小室內，分組和處理同1.4。IR 處理結束后恢復6 h，按常規方法進行免疫熒光實驗[11]。通過倒置熒光顯微鏡觀察細胞內γH2AX，BRCA1和Rad51蛋白焦點形成，計數1000 個細胞中含蛋白焦點陽性細胞數。蛋白焦點形成判定：細胞核內形成明亮而致密的點狀結構即為焦點，每個細胞中含有大而明亮的焦點數目＞10，則可計為1個含γH2AX，BRCA1或Rad51蛋白焦點的陽性細胞。

1.6 細胞克隆形成實驗檢測細胞存活

取生長狀態良好的MCF7/wtp53 和MCF7/dp53細胞，按每皿接種細胞總數4×103，接種于p60培養皿，將2 種細胞各分為8 組：細胞對照組、VPA組（VPA 0.5 mmol·L-1處理24 h）、IR（IR 2，4和6 Gy）組及VPA+IR（IR 2，4 和6 Gy）組，每組3 個平行樣。處理結束后立即更換新鮮的細胞培養液，按常規方法進行細胞克隆形成實驗[12]。繼續培養2 周后，肉眼可見細胞克隆形成則終止培養。濃度0.1%的甲紫工作液染色后，計數各組細胞克隆形成數目和細胞克隆形成率。克隆形成率（%）=克隆形成數/接種細胞數×100%。

1.7 流式細胞術檢測同源重組修復效率

取生長狀態良好的MCF7/pDR-GFP/wtp53 和MCF7/pDR-GFP/dp53 細胞，按每皿細胞總數（2～3）×105分別接種于p60細胞培養皿。2種細胞各分為2 組：細胞對照組和VPA 組（VPA 0.5 mmol·L-1處理24 h），VPA 處理前轉入核酸內切酶I-sceI，藥物處理結束后更換新鮮的細胞培養液；培養72 h后胰酶消化，117×g離心5 min后棄上清，PBS重懸，通過濾網過濾至流式細胞儀檢測管，用流式細胞儀檢測1×105個細胞，統計綠色熒光陽性的細胞數。HR修復效率（%）=綠色熒光陽性細胞數/100 000×100%。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 P53表達下調的同源配對細胞模型的鑒定

Western 印跡實驗結果顯示，與MCF7 細胞相比，含PLKO.1病毒顆粒液感染MCF7細胞后，P53蛋白表達水平未變化；含p53 shRNA病毒顆粒液感染MCF7細胞后，P53蛋白表達水平顯著降低（圖1），提示成功培育p53 表達下調的同源配對細胞MCF7/wtp53和MCF7/dp53細胞。

2.2 VPA 對lR 所 致MCF7/wtp53 和MCF7/dp53細胞DNA雙鏈斷裂損傷的影響

Fig.1 Expression level of protein P53 in human breast cancer MCF7，MCF7/wild type p53（wtp53）and MCF7/defective p53（dp53）cells. B was the semiquantiative result of A. IA：integrated absorbance. s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with MCF7 cell group.

彗星實驗結果（圖2A）顯示，①MCF7/wtp53細胞：與細胞對照組相比，IR 組細胞核拖尾尾距增加1.4 倍（P＜0.05），表明IR 能夠誘導MCF7 細胞產生嚴重的DNA 雙鏈斷裂損傷；與IR 組相比，VPA+IR 組細胞核拖尾尾距增加1.8 倍（P＜0.05），說明VPA能增加IR誘導的MCF7細胞DNA雙鏈斷裂損傷。②MCF7/dp53細胞：與細胞對照組相比，IR組細胞核拖尾尾距增加1.3倍（P＜0.05），表明IR仍可誘導DNA 雙鏈斷裂損傷；與IR 組相比，VPA+IR 組細胞核拖尾尾距雖增加1.2 倍（P＜0.05），但與MCF7/wtp53 細胞VPA+IR 組相比降低76.4%（P＜0.05），表明VPA增強IR誘導DNA雙鏈斷裂損傷的能力被抑制。由此提示，在MCF7/wtp53 細胞中，VPA 具有增強IR 誘導DNA 雙鏈斷裂損傷的作用；抑制p53表達后，VPA對IR的增強作用受到抑制。

免疫熒光結果（圖2B）顯示，①MCF7/wtp53細胞：與細胞對照組相比，IR組含γH2AX焦點細胞百分率升高39.1%（P＜0.05），表明IR 可誘導嚴重的DNA 雙鏈斷裂損傷；與IR 組相比，VPA+IR 組含γH2AX 焦點細胞百分率升高20.5%（P＜0.05），表明VPA能進一步增強IR所致的乳腺癌細胞DNA雙鏈斷裂損傷。②MCF7/dp53 細胞：與細胞對照組相比，IR 組含γH2AX 焦點細胞百分率升高16.7%（P＜0.05）；與IR組相比，VPA+IR 組含γH2AX焦點細胞百分率雖升高16.3%（P＜0.05），但相較于MCF7/wtp53 細胞VPA+IR 組仍降低30.0%（P＜0.05），表明VPA 增強IR 誘導雙鏈斷裂損傷的能力受到抑制。由此提示，在MCF7/wtp53 細胞中，IR可誘導嚴重的DNA 雙鏈斷裂損傷，且VPA 能增強IR 誘導的DNA 雙鏈斷裂損傷；抑制p53 表達后，VPA增強IR誘導DNA 雙鏈斷裂損傷的能力受到抑制，與彗星實驗結果相一致。

2.3 VPA 對lR 所 致MCF7/wtp53 和MCF7/dp53細胞存活的影響

Fig.2 Effect of valproic acid（VPA）on ionizing radiation（lR）-induced DNA double strand breaks（DSB）damage in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells. VPA group：VPA 0.5 mmol·L-1 treatment for 24 h；IR group：IR 8 Gy；VPA+IR group：VPA 0.5 mmol·L-1 pretreatment for 24 h，then IR 8 Gy. A：comet tail of the DNA damage A1 and comparison of comet tail length（A2）；B：expression of γH2AX focus formation，DNA DSB（B1）and percentage of cells containing γH2AX focus formation（B2）. s，n=3. ＊P＜0.05，compared with corresponding cell control group；#P＜0.05，compared with corresponding IR group；△P＜0.05，compared with VPA+IR group in MCF7/wtp53 cells.

細胞克隆形成實驗結果（圖3A和B）顯示，未給予IR 處理時，①MCF7/wtp53 細胞：與細胞對照組相比，VPA 組克隆形成率降低23.0%（P＜0.05）。②MCF7/dp53 細胞：細胞對照組克隆形成率與MCF7/wtp53 細胞的細胞對照組相比升高50.3%（P＜0.05）；與細胞對照組相比，VPA 組克隆形成率降低13.6%（P＜0.05），但與MCF7/wtp53 細胞VPA組相比仍升高59.7%（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of VPA on lR induced survival in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells. MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells were divided into 8 groups respectively：cell control group，VPA group（VPA 0.5 mmol·L-1 treatment for 24 h），IR groups（IR 2，4 or 6 Gy）and VPA+IR groups（VPA 0.5 mmol·L-1 pretreatment for 24 h，IR 2，4 or 6 Gy）.A：the clone formation in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells；B：the plating efficiency was measured without IR treatment in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells；C：the survival fraction was measured in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells.，n=3. ＊P＜0.05，compared with cell control group in MCF7/wtp53 cells；#P＜0.05，compared with VPA group in MCF7/dp53 cells.

細胞在IR 處理后，隨著IR 劑量的增加，各組細胞克隆形成率均呈逐漸降低趨勢（圖3A和C）。①MCF7/wtp53 細胞：與IR（2 Gy）組相比，VPA+IR（2 Gy）組克隆形成率降低8.4%（P＜0.05）；與IR（4 Gy）組相比，VPA+IR（4 Gy）組克隆形成率降低20.4%（P＜0.05），表明VPA 能增強IR 殺傷MCF7細胞的能力。②MCF7/dp53細胞：IR（2 Gy）組克隆形成率與MCF7/wtp53 細胞IR（2 Gy）組相比升高5.9%（P＜0.05）；IR（4Gy）組克隆形成率與MCF7/wtp53 細胞IR（4 Gy）組相比升高17.1%（P＜0.05）；IR（6 Gy）組克隆形成率與MCF7/wtp53 細胞IR（6 Gy）組相比升高21.6%（P＜0.05），表明p53被抑制后，細胞對IR呈耐受狀態；VPA+IR（2 Gy）組克隆形成率與IR（2 Gy）組相比無明顯變化，但相較于MCF7/wtp53 細胞VPA+IR（2 Gy）組仍升高13.2%（P＜0.05）；VPA+IR（4Gy）組克隆形成率與IR（4Gy）組相比降低9.1%（P＜0.05），但相較于MCF7/wtp53 VPA+IR（4 Gy）組仍升高28.4%（P＜0.05）；VPA+IR（6 Gy）組克隆形成率與IR（6 Gy）組相比降低7.7%（P＜0.05），但相較于MCF7/wtp53 細胞VPA+IR（6 Gy）組仍升高13.8%（P＜0.05），表明在MCF7/dp53 細胞中，VPA 增強IR 殺傷細胞的能力受到抑制。結合彗星和免疫熒光實驗結果，提示在MCF7/wtp53 細胞中，VPA 能增強IR 誘導的DNA雙鏈斷裂損傷以及IR對MCF7細胞的殺傷能力，即VPA 增加MCF7 細胞對IR 的敏感性，表現為VPA明顯的放射增敏作用；但抑制p53 表達后，VPA 的放射增敏作用受到抑制。

2.4 VPA在MCF7/wtp53和MCF7/dp53細胞中放射增敏作用的機制

Fig.4 Mechanism of homologous recombination（HR）repair in MCF/wtp53 and MCF7/dp53 cells. A：the effect of VPA 0.5 mmol·L-1 treatment for 24 h on HR efficiency；A1：flow cytometry；A2：HR efficiency. s，n=3. ＊P＜0.05，compared with cell control group in MCF7/pDR-GFP/wtp53 cells；#P＜0.05，compared with VPA group in MCF7/pDR-GFP/dp53 cells. B and C：BRCA1 and Rad51 focus formation；B1 and C1：BRCA1 and Rad51 focus formation；B2 and C2：the percentage of cells containing BRCA1 and Rad51 focus formation.DAPI was used to stain nucleus.See Fig.2 for the cell treatment.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with MCF7/wtp53 cell control group；#P＜0.05，compared with MCF7/wtp53 IR group；△P＜0.05，compared with MCF7/dp53 VPA+IR group.

流式細胞術結果顯示（圖4A），①MCF7/pDRGFP/wtp53細胞：與細胞對照組相比，VPA組HR修復效率顯著降低51.6%（P＜0.05）。②MCF7/pDRGFP/dp53 細胞：細胞對照組與MCF7/pDR-GFP/wtp53細胞的細胞對照組相比，HR效率升高49.0%（P＜0.05）；與細胞對照組相比，VPA 組HR 效率降低20.3%（P＜0.05），但與MCF7/pDR-GFP/wtp53細胞VPA 組相比仍升高80.3%（P＜0.05）。結果提示，抑制p53表達后，HR修復能力增強。

免疫熒光實驗結果顯示（圖4B 和C），①MCF7/wtp53細胞：與細胞對照組相比，IR 組含BRCA1 焦點細胞百分率升高19.4%（P＜0.05），含Rad51焦點細胞百分率升高40.0%（P＜0.05），表明IR 能激活MCF7/wtp53 中BRCA1-Rad51 介導的HR 修復機制；與IR組相比，VPA+IR 組含BRCA1焦點細胞百分率降低15.6%（P＜0.05），含Rad51焦點細胞百分率降低20.4%（P＜0.05），提示IR 激活的BRCA1-Rad51介導HR修復機制被VPA抑制，表現為VPA的放射增敏作用。②MCF7/dp53 細胞：IR 組與MCF7/wtp53 細胞IR 組相比，含BRCA1 焦點細胞百分率升高31.7%（P＜0.05），含Rad51焦點細胞百分率升高27.6%（P＜0.05），表明抑制p53 表達后，IR激活的BRCA1-Rad51介導的HR機制處于過度增強狀態；與IR組相比，VPA+IR 組含BRCA1焦點細胞百分率降低5.8%（P＜0.05），含Rad51 焦點細胞百分率降低8.6%（P＜0.05），但與MCF7/wtp53細胞VPA+IR組相比，VPA+IR組含BRCA1焦點細胞百分率升高41.5%（P＜0.05），含Rad51焦點細胞百分率升高39.4%（P＜0.05），表明VPA 抑制IR 激活HR修復機制的能力受到影響，BRCA1-Rad51介導的HR 機制仍處于過度增強的狀態，表現為VPA的放射增敏作用受到抑制，細胞呈現放射耐受狀態。上述結果提示，抑制p53表達后，BRCA1-Rad51 介導的HR機制的過度增強可能與VPA對細胞放射增敏作用的下調有關。

3 討論

已有研究表明，VPA 作為抗腫瘤藥物，不但有效抑制癌細胞生長，且對多種腫瘤細胞具有放射增敏作用[2，5-7]。本課題組研究還表明，VPA放射增敏作用與DNA 損傷修復機制有關，可通過干擾BRCA1-Rad51 介導的HR 修復機制，增強IR 對乳腺癌細胞的殺傷作用[2]。BRCA1 與Rad51 是HR修復中的關鍵蛋白，在DNA 雙鏈斷裂損傷修復中發揮重要的作用，提示VPA可能是極有應用前景的腫瘤放療增敏劑，DNA 損傷修復蛋白（BRCA1 與Rad51 等）可能是其作用的靶點。本研究結果揭示，在MCF7/wtp53 細胞中，VPA 能顯著抑制其生長，增強MCF7/wtp53細胞對放射的敏感性；但相對于MCF7/wtp53細胞，MCF7/dp53細胞則表現出對放射的耐受，VPA 抑制其生長的能力降低，以及對MCF7/dp53細胞的放射增敏作用也被抑制，進一步提示VPA的放射增敏作用是受p53功能狀態的影響。

已有研究報道，p53表達缺欠后，腫瘤對放療的敏感性受到抑制，表現出對放射治療的耐受性[13-14]，且該機制目前還不完全清楚。本研究發現，在無應激刺激時，p53 的表達缺欠導致BRCA1 和Rad51 活性增強，這與本課題組已往研究結果一致，是由于p53 表達缺欠導致的自發同源重組修復效率增強，表現為BRCA1和Rad51活性增強，這種增強作用可能與細胞復制阻滯有關[8]。本課題組已有研究表明，在HR修復過程中存在p53抑制HR和BRCA1 促進HR 兩種截然不同的機制，維持2 種機制處于平衡狀態對于保證正常的HR修復功能具有重要意義，如果破壞這種平衡狀態將會影響腫瘤細胞對放射的敏感性[8]。當p53 表達缺欠時，出現BRCA1和Rad51活性過度增強，HR修復能力也隨之過度增強，細胞呈現出對放射的耐受[8]。本研究結果提示，細胞在無IR 處理條件下，p53 缺欠就可引起MCF7/dp53 細胞增殖能力增強，此時VPA 抑制其生長的作用也顯著下降，其機制可能與BRCA1 和Rad51 活性以及HR 修復能力增強有關[8]。如用IR處理后，MCF7/dp53細胞對放射的敏感性顯著下降，此時VPA對其放射增敏作用也被顯著下調，MCF7/dp53 細胞呈現放射耐受狀態，其原因是在應激狀態下，MCF7/dp53細胞仍然顯示出過強的BRCA1 和Rad51 活性與HR 修復能力，也提示p53依賴的VPA所致MCF7/dp53細胞放射耐受作用與細胞的DNA損傷修復能力有關。

有研究表明，p53 基因突變見于＞50%腫瘤患者，而且p53 的表達狀態對腫瘤放療的療效和患者的預后有重要的意義[15]。本研究結果提示，應用VPA 作為乳腺癌的放療增敏劑治療腫瘤時還應考慮p53功能狀態，這為VPA用于臨床治療乳腺腫瘤提供了理論和實驗依據。