花青素Cyanidin-3-O-glucoside對脂多糖和白介素-4刺激的小鼠骨髓巨噬細胞極化的影響①

張曉靜 崔夢珂 辛廣遠 李衛國

(河南師范大學生命科學學院,新鄉453007)

巨噬細胞來源于單核細胞，是機體重要的固有免疫細胞，經刺激后可極化成為經典活化型巨噬細胞(M1型)和交替活化型巨噬細胞(M2型)。在體外培養條件下，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激可使巨噬細胞極化為M1型，主要分泌促炎介質TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS等；而IL-4刺激可使巨噬細胞極化為M2型，主要分泌抑炎介質IL-10、Arg-1等。近年來研究表明，巨噬細胞極化與一些代謝性疾病存在著密切的關系，如動脈粥樣硬化、肥胖型糖尿病等常見慢性炎性疾病。相較于正常機體，隨著慢性炎性疾病的加重，M1型巨噬細胞數量增多，M2型巨噬細胞數量下降[1,2]。因此，改變M1和M2型巨噬細胞在病變組織的比例或者改變組織微環境，可能有利于治療或緩解慢性炎性病癥。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-glucos-ide,C3G)是樹莓果實的主要花青素，具有抗氧化、抗癌、殺菌等多種生物學活性[3-5]。近年來研究表明，花青素具有明顯的抗炎效果，Ferrari等[6]發現C3G能夠抑制TNF-α刺激的腸上皮細胞NF-κB信號通路，并通過激活核因子紅系2-相關因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)通路發揮保護作用。還有研究表明，草莓花青素天竺葵-3-O-葡萄糖苷(Pelargonidin-3-O-glucoside,P3G)也能發揮抗炎作用。Duarte等[7]的體內實驗表明P3G能抑制白細胞滲出、遷移及炎癥因子的分泌，提示P3G具有抗炎效果；體外細胞培養實驗進一步表明P3G的抗炎機制與IκBα活化的抑制和降低JNK/MAPK磷酸化有關。Amini等[8]研究了草莓P3G及其代謝產物對LPS誘導的THP-1單核細胞和巨噬細胞炎性細胞因子分泌的影響，他們發現用P3G及其中間代謝物處理THP-1單核細胞后，僅出現了IL-6濃度降低。此外，王靜等[9]利用小鼠炎癥模型研究了金葉女貞果實花青素的抗炎鎮痛效果；而陳美珺等[10]的研究表明原花青素通過抑制NF-κB/p65蛋白表達和抑制NF-κB信號通路，抑制LPS誘導的RAW264.7細胞前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)的分泌，提示原花青素具有抗炎作用。但樹莓花青素C3G能否通過影響巨噬細胞炎性細胞介質表達和生成，影響巨噬細胞的極化，未見相關研究報道。本文以原代培養的小鼠髓源性巨噬細胞(Bone marrow derived macrophages,BMDM)為材料，利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，檢測C3G對LPS誘導的M1型巨噬細胞促炎細胞介質和C3G對IL-4誘導的M2型巨噬細胞抑炎細胞介質表達的影響，旨在探討樹莓花青素C3G影響巨噬細胞極化的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物購于華蘭生物有限公司實驗動物中心，C3G(質量分數>98%)購于成都迅琛生物科技有限公司；RPMI1640培養基購于Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購于康寧公司，青霉素-鏈霉素購于Solarbio公司，MTT、IL-4和LPS購于Sigma公司，M-CSF購于R&D公司，IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-10、Arg-1的ELISA試劑盒購于Magen公司，提取RNA試劑盒、反轉錄試劑盒以及qPCR試劑盒購于Magen公司。

1.2 方法

1.2.1 BMDM制備 參照王衛芳等[11]制備BMDM方法，取10只8～10周齡的BALB/c雄性小鼠，取其股骨，沖洗出股骨中骨髓細胞，經細胞篩過濾，轉至培養瓶中。在37℃，5%CO2條件下培養2～4 h，棄未貼壁細胞，加入含有100 ng/ml M-CSF完全培養液，隔天換液，第7天成功誘導為BMDM，液氮中保存，以備后續使用。

1.2.2 MTT法檢測BMDM的細胞活性 BMDM細胞以每孔1×105個細胞接種于96孔板中，每孔200 μl，分為調零組、正常對照組和添加1、5、10、15、20、25和30 μg/ml的C3G組，每組設5個平衡孔，其中調零組只加完全培養液，不加細胞。孵育24 h后，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續培養4 h，棄上清。每孔加入150 μl DMSO溶液，振蕩10 min，使結晶充分溶解，酶標儀在570 nm處測定吸光度A值，按下式計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組A-調零組A)/(對照組A-調零組A)×100%。

1.2.3 ELISA檢測BMDM炎性介質的蛋白生成水平 將BMDM以每孔1×106個細胞接種于6孔板中，每孔2 ml。對于M1型巨噬細胞實驗的分組為：正常對照組、LPS組、LPS+C3G(5、10和20 μg/ml)3個實驗組，每組設3個平衡孔；正常對照組僅加入培養基，LPS組僅加入1 μg/ml 的LPS處理，實驗各組加入LPS前12 h加入給定濃度的C3G，再加入1 μg/ml LPS共培養12 h。對于M2型巨噬細胞實驗的分組為：正常對照組、IL-4組、IL-4+C3G(5、10和20 μg/ml)3個實驗組，每組設3個平衡孔；正常對照組僅加入培養基，IL-4組僅加入20 ng/ml IL-4處理，實驗組各加入5、10和20 μg/ml的C3G和20 ng/ml IL-4共培養24 h。然后取細胞培養液，3 000 r/min離心取上清，用ELISA雙抗體夾心法測定各組M1型巨噬細胞的促炎細胞介質IL-6、IL-1β、TNF-α、單核趨化蛋白-1(Mononuclear chemotactic protein-1，MCP-1)和iNOS蛋白生成量及各組M2型巨噬細胞的抑炎細胞介質IL-10和Arg-1蛋白生成量。具體操作按制造商提供的說明書進行，酶標儀測定吸光度A(450 nm)值，根據標準曲線分別確定其含量。

1.2.4 qRT-PCR分析BMDM炎性介質的mRNA水平 BMDM細胞以每孔1×106個細胞接種于6孔板中，每孔2 ml， 對M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞的實驗分組同前述1.2.3。吸棄培養液，用PBS緩沖液沖洗2次，依次按照RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒以及qPCR試劑盒說明進行操作，分別提取總mRNA，反轉錄cDNA，再進行PCR，最后計算M1型巨噬細胞各組IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1和iNOS的mRNA水平，以及M2型巨噬細胞各組IL-10和Arg-1 mRNA水平。qPCR所用引物見表1。

2 結果

2.1 C3G對體外培養的BMDM活性的影響 為了解C3G對體外培養BMDM的細胞毒性，本研究采用MTT法分析了1、5、10、15、20、25和30 μg/ml C3G對小鼠BMDM細胞活力的影響，見圖1。MTT實驗結果顯示，與對照組相比，1、5、10、15和20 μg/ml C3G對小鼠BMDM活力的促進作用逐漸增強，而25 μg/ml 和30 μg/ml C3G的促進作用又逐漸減弱，除20 μg/ml C3G的促進作用差異有顯著性意義外，其余濃度的C3G對小鼠BMDM細胞活力均無明顯影響。依據本實驗結果，并參照Serra等[12]結果，本研究采用5、10和20 μg/ml C3G進行后續實驗。

表1 β-actin、IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-10和Arg-1基因的引物序列

Tab.1 Primer sequence of β-actin，IL-6，IL-1β，TNF-α，MCP-1，iNOS，IL-10 and Arg-1 gene

CytokinesPrimer sequenceβ-actin-S5'-CGTCAGGCAGCTCATAGCTCTTCT-3'β-actin-A5'-TGGCTACAGCTTCACCACCACAG-3'IL-6-S5'-GAAATGATGGATGCTACCAAACTG-3'IL-6-A5'-GACTCTGGCTTTGTCTTTCTTGTT-3'IL-1β-S5'-TCAAATCTCGCAGCAGCACATC-3'IL-1β-A5'-CGTACACACCCAGCAGGTTATC-3'TNF-α-S5'-TACTGAACTTCGGGGTGATCG-3'TNF-α-A5'-GGGTCTGGGCCATAGAACTGA-3'MCP-1-S5'-AGGTGTCCCAAAGAAGCTGTAGT-3'MCP-1-A5'-TTTGGTTCCGATCCAGGTTTT-3'iNOS-S5'-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3'iNOS-A5'-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3'IL-10-S5'-ACCTGGTAGAAGTGATGCC-3'IL-10-A5'-CAAGGAGTTGTTTCCGTTA-3'Arg-1-S5'-CCAGAAGAATGGAAGAGTCAGTGT-3'Arg-1-A5'-GCAGATATGCAGGGAGTCACC-3'

2.2 C3G抑制LPS刺激的BMDM促炎細胞因子表達與生成 本研究運用qRT-PCR和ELISA技術分析了不同濃度C3G對LPS刺激的BMDM促炎細胞因子mRNA表達與蛋白生成的影響。與正常對照組相比，單獨用1 μg/ml LPS處理，BMDM的促炎細胞介質IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1和iNOS的mRNA水平和蛋白水平顯著升高，差異具有極顯著性意義。而LPS+C3G共處理組與單獨LPS處理組相比，BMDM促炎細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1和iNOS的mRNA表達水平與蛋白生成水平均出現下調，差異具有極顯著性意義，見圖2A～E。然而，需要注意的是，與5 μg/ml和20 μg/ml C3G處理相比，10 μg/ml C3G對BMDM促炎細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表達與蛋白生成水平的抑制作用更強，對BMDM趨化因子MCP-1 mRNA表達與蛋白生成水平的抑制作用更弱，見圖2D，而C3G對BMDM炎性因子iNOS的mRNA表達與蛋白生成水平的抑制作用卻呈現出明顯的劑量依賴性，見圖2E。

2.3 C3G增強IL-4刺激的BMDM抑炎細胞因子mRNA表達與蛋白生成 本研究運用qRT-PCR和ELISA技術分析了C3G對IL-4刺激BMDM抑炎細胞因子的基因表達與蛋白生成的影響。與正常對照組相比，單獨用20 ng/ml IL-4處理可引起抗炎因子IL-10和Arg-1顯著上調(如圖3)。而用IL-4 10 μg/ml C3G及IL-4 20 μg/ml C3G共處理后，BMDM的IL-10和Arg-1 mRNA表達量和蛋白生成量較單獨用IL-4處理進一步增強，表現出明顯的劑量依賴性。

圖1 C3G對小鼠BMDM的細胞活性影響Fig.1 Effect of C3G on cell viability of BMDMsNote: *.P<0.05 vs the control group.

圖3 C3G增強IL-4刺激的髓源性巨噬細胞抑炎細胞介質mRNA表達和蛋白生成Fig.3 C3G promotes IL-4-stimulated mRNA expression and production of anti-inflammatory mediators in BMDMsNote: && and $$.P<0.01 vs the control group;** and ##.P<0.01 vs IL-4 treatment group.

3 討論

巨噬細胞具有較強的可塑性，改變體內外微環境均可引起巨噬細胞的表型轉換[1]。在體外條件下，LPS和INF-γ能夠誘導未極化的巨噬細胞成為M1型巨噬細胞，分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS等促炎細胞因子，發揮促炎作用；而IL-4能夠誘導未極化的巨噬細胞成為M2型巨噬細胞，分泌IL-10、Arg-1等抗炎細胞因子，發揮抑炎作用。炎癥反應對機體防止細菌等感染固然有一定的保護作用，但過度的炎癥反應又會給機體帶來一定的損傷。因此，在一定程度上抑制M1型巨噬細胞極化、增強M2型巨噬細胞極化有助于減少炎癥反應對機體的損傷[13，14]。許多研究表明，多種常見的慢性疾病，如肥胖型糖尿病、動脈粥樣硬化、癌癥等均與機體輕度慢性炎性反應存在密切的聯系。研究表明，肥胖個體的脂肪組織巨噬細胞高表達TNF-α、IL-6、iNOS等促炎細胞因子，而正常個體的脂肪組織巨噬細胞高表達IL-10、Arg-1等抑炎細胞因子；由于促炎細胞因子能干擾胰島素的正常功能，使機體產生胰島素抵抗，因此改變機體組織的M1和M2型巨噬細胞的比例將有利于緩解肥胖型糖尿病的病情[15]。

近年來研究表明，花青素具有抗氧化、抗癌、殺菌、抗炎等多種功效，樹莓果富含C3G等花青素成分。為探討樹莓花青素C3G對巨噬細胞極化作用的影響，我們以原代培養的小鼠BMDM為材料，研究C3G對巨噬細胞炎性細胞介質mRNA表達和蛋白生成的影響。對于BMDM的M1表型特征，本研究選擇M1巨噬細胞的標志性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和iNOS進行分析。IL-1β是分泌型促炎細胞因子，介導巨噬細胞趨化性，是早期炎癥反應的標志物，可誘導IL-6、IL-8等促炎細胞因子的生成。TNF-α是重要的特征性炎癥細胞因子，處于炎癥級聯反應的中心環節，其表達量的多少直接反映炎癥的嚴重程度。IL-6是一種多功能細胞因子，參與多個生物反應過程，如炎癥、免疫細胞分化等[16]。MCP-1是巨噬細胞產生的重要促炎細胞因子，對單核/巨噬細胞具有特異性趨化激活作用。精氨酸在iNOS的作用下生成NO是M1型巨噬細胞的顯著特征，NO的過量生成與炎癥反應密切相關，因而iNOS表達水平能夠反映M1型巨噬細胞極化程度。從本研究結果來看，5、10和20 μg/ml的C3G均可以下調LPS刺激BMDM促炎細胞介質IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和iNOS的表達與生成，特別是10 μg/ml C3G對IL-6、IL-1β、TNF-α表達的下調作用最為明顯，但10 μg/ml C3G對MCP-1表達的下調作用較弱，5、10和20 μg/ml的C3G對iNOS表達的下調作用具有劑量依賴效應。這一結果提示C3G對BMDM不同炎性細胞因子表達的抑制作用是有差異的，具有濃度選擇性。

目前，花青素對M2型巨噬細胞極化影響作用鮮有研究。Meireles等[17]探討了花青素對小膠質細胞M1/M2表型的影響，他們分別用1 μmol矢車菊素(Cyanidin,Cy)、矢車菊素-3-葡萄糖(Cyanidin-3-glucose,Cy3glc)和甲基化矢車菊素-3-葡萄糖(Met-Cy3glc)等三種花青素與LPS/IL-4共處理N9小膠質細胞，結果顯示Cy3glc能顯著抑制LPS刺激的IL-6 mRNA表達，Cy降低LPS誘導的IL-1β表達，原花青素及其代謝物并不能使小膠質細胞轉換為典型的M2表型。然而，本研究的結果顯示IL-4刺激不僅可誘導BMDM具有M2表型，而且C3G能顯著上調IL-4刺激的BMDM的IL-10和Arg-1表達，且隨C3G濃度升高，IL-10與Arg-1表達量逐漸升高，呈現出劑量依賴效應。說明C3G能夠影響BMDM的表型轉變。

綜上所述，花青素C3G既能抑制LPS刺激的BMDM促炎細胞因子表達，也能增強IL-4刺激的BMDM抑炎細胞因子表達，表明花青素C3G能夠影響BMDM極化。總之，花青素C3G既能抑制LPS誘導BMDM促炎細胞因子的表達，也能增強IL-4誘導BMDM抑炎細胞因子的表達，提示C3G能夠調控BMDM的極化。