細胞自噬調控顱內動脈瘤血管平滑肌細胞表型轉化的體外研究①

袁廣勝 吳海東 陳勝利 李小梅 邵 楠 王紀斌 張 婷

(東營勝利醫院，東營257055)

血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)與其他類型的細胞如血管內膜的內皮細胞、心肌細胞和骨骼肌細胞等相比較，保留高度的可塑性[1]。在正常狀態下，VSMCs具有收縮和舒張血管、維持血壓平衡、調節血管張力和血流量等功能。當細胞周圍環境發生改變時，VSMCs發生可逆轉的表型轉化，由生理狀態下的收縮表型(分化表型)轉變為合成表型(去分化表型)，由此獲得增殖、遷移及合成分泌大量細胞外基質和促炎因子的能力[2]。VSMCs表型轉化是細胞自我修復的機制，同時也成為新生內膜形成和管腔狹窄的重要病理基礎。最新文獻報道顯示VSMCs和VSMCs表型轉化在顱內動脈瘤(intracranial aneurysms，IAs)的形成、進展和破裂中發揮重要作用[1,3,4]。IAs的形成是血流動力學因素以及一系列復雜的生物學反應所引起的腦血管瘤樣突起，人群平均患病率1%～5%，高風險人群為19%[5]。IAs破裂是引起自發性蛛網膜下腔出血的首位原因，致殘率和致死率高達 25%～50%，嚴重威脅人類生命和健康[6]。目前，IAs臨床治療主要包括手術治療和血管介入治療，尚未發現有效的藥物。因此，深入闡述IA的分子生物學機制對于提供有效的藥物靶點至關重要。本研究以體外培養的VSMCs為研究對象，揭示流體切應力對VSMCs表型轉化的影響及相關的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM低糖培養基、無血清培養基Opti-MEM、胎牛血清及胰蛋白酶(美國Gibco公司產品)，實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)，兔抗大鼠LC3、Beclin-1多克隆抗體(Sigma 公司)，兔抗大鼠β-actin 單克隆抗體(艾比瑪特生物醫藥有限公司)，兔抗大鼠α-SMA、SM-22a、SM-MHC多克隆抗體，兔抗大鼠MMP-2和TNF-α多克隆抗體(美國 Santa 公司)，免疫組織化學試劑盒SABC、DAB顯色試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自武漢博士德生物技術有限公司，Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 VSMCs培養及鑒定 大鼠腦VSMCs購自A.T.C.C.(Manassas,VA,U.S.A.)。VSMCs用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基培養，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，實驗用第3～5代細胞。應用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態和α-SMA的免疫細胞化學染色對VSMCs進行鑒定。

1.2.2 流體切應力沖擊VSMCs 將傳至3～5代的VSMCs接種到載玻片上，待細胞融合達到60%～70%后轉移到流室的測試區，密封后進行流體剪切實驗。提供的流室內剪切力為15.28 dyne/cm2，細胞經15.28 dyne/cm2流體剪切力分別處理6、12、24 h。蠕動泵為實驗系統提供穩定的定常流，用無血清DMEM 培養基作為灌流液體。對照組VSMCs靜止培養，不經剪切力處理。SS+3-MA組與SS+Rapa組分別于流體剪切力沖擊VSMCs前6 h給予3-MA或 Rapa預處理。

1.2.3 Real-time PCR 分別收集各組各時間點細胞，按照總RNA抽提取試劑盒說明書提取mRNA，反轉錄及定量PCR反應均按試劑說明書操作。引物序列如下:α-SMA引物序列:上游5′-AGTCGCCATCAGGAACCTCGAG-3′，下游5′-ATCTTTTCGATGTCGTCCCAGTTG-3′；SM-22a引物序列:上游5′-GCATAAGAGGGAGTTCACAGACA-3′，下游5′-GCCTTCCCTTTCTAACTGATGATC-3′；MMP-2引物序列:上游5′-CCAGCCAGTCCGATTTGA-3′，下游5′-CTGATAACCTGGATGCAGTCGT-3′；TNF-α引物序列:上游5′-AAAGCATGATCCGAGATGT-3′，下游5′-AGCAGGAATGAGAAGAGGC-3′；內參GAPDH引物序列:上游5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游5′-TTTAATCTCACGCACGATTTC-3′。 反應條件:94℃預變性3 min，94℃擴增變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環，使用2-ΔΔCt法計算 mRNA 表達量。

1.2.4 免疫細胞化學染色 將接種于置有滅菌蓋玻片的24孔板，每孔約1×105個，細胞融合至50%～70%時用甲醛固定，加入3%雙氧水浸泡，5% BSA封閉液30 min，甩干后滴加兔抗大鼠的α-SMA 和LC-3多克隆抗體(稀釋度均為1∶100)，4℃孵育過夜。次日用PBS漂洗3次，5 min/次，滴加羊抗兔的辣根過氧化物酶標記的IgG，37℃孵育30 min，SABC液孵育40 min，DAB顯色3～5 min。終止反應后蘇木精復染、脫水、透明、中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.5 Western blot法 收集各組細胞，按常規方法提取蛋白質，以12 000 r/min離心15 min后留取上清。BCA法測定上清液蛋白濃度，蛋白變性后進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，以干轉法將分離蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，電轉時間為50 min。5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，滴加兔抗大鼠多克隆抗體(稀釋度1∶500)，4℃孵育過夜。次日以TBST洗膜5次，5 min/次，滴加羊抗兔的二抗(稀釋度1∶5 000)，室溫孵育2 h，以TBST洗膜5次，5 min/次，ECL顯色液進行曝光。Image J醫學圖像分析系統進行半定量分析，以β-actin作為內參計算蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 VSMCs的鑒定結果 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態可見貼壁細胞以梭形為主，也呈現不規則形或星形，有多個細胞突起，胞漿豐富，細胞核卵圓形位于中央，某些區域重疊生長，表現為典型的“谷峰狀”生長(圖1A)。免疫細胞化學染色:制作細胞爬片，待細胞融和達到 50%～70% 時，使用特異性抗體α-SMA 鑒定VSMCs，光鏡下可見胞漿呈現深棕黃色，證實細胞α-SMA相關抗原表達呈現陽性(圖1B)，鑒定細胞為VSMCs。

2.2 流體切應力誘導VSMCs的表型轉化 與對照組比較，SS組VSMCs的收縮表型標志基因α-SMA(P6 h=0.026 2,P12 h=0.014 1,P24 h=0.004 0)，SM-22a(P6 h=0.031 8,P12 h=0.016 5,P24 h=0.008 2)mRNA水平明顯下調，而合成表型標志基因MMP-2(P6 h=0.010 4,P12 h=0.004 9,P24 h=0.000 3)和TNF-α(P6 h=0.022 1,P12 h=0.007 4,P24 h=0.000 8)的mRNA水平明顯上調，從6 h到24 h下調/上調基因的改變均呈現顯著的時間依賴性。這些結果表明流體切應力可促進VSMCs由收縮表型向合成表型的轉化(圖2)。

2.3 流體切應力促進VSMCs的自噬激活 據報道自噬在血管重塑中扮演重要角色，參與多種血管疾病的病理過程。為了明確流體切應力是否可激活VSMCs自噬，我們采用免疫細胞化學檢測自噬相關蛋白LC3的蛋白定位情況，結果顯示:流體切應力暴露后24 h，VSMCs胞漿呈現深棕褐色，免疫反應強陽性，揭示流體切應力可激活VSMCs自噬(圖3)。為進一步驗證這一結論，采用免疫印跡的方法檢測不同時間點VSMCs中LC3和Beclin-1的蛋白表達情況。結果顯示:SS組與正常組相比VSMCs中LC3和Beclin-1的蛋白表達明顯升高(P<0.05,圖4)。

圖1 VSMCs的鑒定結果Fig.1 Identification results of VSMCsNote: Morphological feature of VSMCs under inverted phase contrast microscope(A) and the locational expression of α-SMA in VSMCs(B),Bar=20 μm.

圖2 VSMCs收縮表型與合成表型標志基因的表達Fig.2 Expressions of VSMCs contractile and synthetic marker genesNote: Real-time PCR results showed that SS could induced phenotypic modulation of VSMCs.*.P<0.05 vs control group.

2.4 自噬可調控SS誘導的VSMCs的表型轉化 如上的結果已經證實流體切應力可誘導VSMCs自噬的激活，但激活的自噬在VSMCs表型轉化中的調控作用尚不明確。本研究在流體切應力沖擊前6 h 用自噬激動劑(Rapa)或抑制劑(3-MA)預孵育細胞，探討自噬水平的高低對VSMCs表型轉化的影響。與SS組相比，自噬激動劑組VSMCs中α-SMA 和SM-22a蛋白表達顯著升高，而MMP-2和TNF-α的表達明顯降低(P<0.05)，表明自噬水平上調能夠促進流體切應力誘導的VSMCs表型轉化。與之相反，自噬水平下調可以顯著抑制流體切應力誘導的α-SMA和SM-22a的下調，以及MMP-2和TNF-α表達的上調(P<0.05)，揭示自噬水平下調可以抑制流體切應力誘導的VSMCs表型轉化。總之，這些結果表明流體切應力通過激活自噬調控VSMCs的表型轉化(圖5)。

圖3 自噬標記分子在VSMCs中的蛋白定量表達Fig.3 Location of autophagy marker protein LC3 inVSMCsNote: Immunocytochemical staining indicated that SS could effectively induced the expression of LC3 in the cells,Bar=20 μm.

圖4 VSMCs中LC3和Beclin-1的蛋白表達變化Fig.4 Expression of autophagy protein LC3 and Beclin-1 in VSMCsNote: Representative photographs and Histograms of Western blot.*.P<0.05 vs control group.

圖5 Rapa 和 3-MA 預處理對 α-SMA、SM-22a、MMP-2和TNF-α蛋白表達的影響Fig.5 Effects of Rapa or 3-MA on α-SMA，SM-22a，MMP-2 and TNF-α expressionsNote: Representative photographs and Histograms of Western blot.*.P<0.05 vs control group; #.P<0.05 vs SS group.

3 討論

VSMCs不是終末分化細胞，其可以調節自身表型以適應周圍環境因素的改變。文獻已報道VSMCs由分化狀態(收縮表型)向去分化狀態(合成表型)的轉化在多種增生性心血管疾病中扮演重要角色，包括動脈粥樣硬化、高血壓、血管成形術后再狹窄等[7]。近年來越來越多的研究表明VSMCs表型轉化也參與了IAs的形成、發展及破裂[3,4]。在IAs形成早期，VSMCs遷移到內膜中，增殖并合成大量細胞外基質成分。Nakajima等[8]應用免疫組織化學的方法在IAs的瘤壁中清晰顯示VSMCs的表型轉化，即瘤壁VSMCs的收縮表型標志蛋白表達減少，合成表型蛋白表達增多，然而在破裂動脈瘤中兩種表型均消失。VSMCs由收縮表型到合成表型的轉化，其增殖和合成新細胞外基質，最終可增強不斷退化的IAs瘤壁的抗拉強度。因此，調控VSMCs表型轉化在IAs瘤壁的退化和最終破裂中至關重要。本研究采用流體切應力誘導體外培養大鼠VSMCs表型轉化模型，模擬IAs發生發展中VSMCs的病理改變，揭示VSMCs表型轉化的上游分子調控機制，為IAs的早期診斷及藥物治療提供新的靶點。

血流切應力是引發IAs發生及其發展的首要因素。近年來研究發現Willis環大動脈局部的高切應力參與了顱內動脈瘤的發病機制[9]。并且流體切應力可以調節VSMCs的增殖、遷移、分化及內皮細胞的功能[10]。因此本研究第一部分以大鼠動脈VSMCs為研究對象，觀察不同時間流體切應力沖擊VSMCs能否誘導體外培養VSMCs的表型轉化。Real-time PCR和免疫印跡結果顯示流體切應力作為一種應激刺激因素，可降低VSMCs的收縮表型(分化表型)標志基因的表達水平，然而可上調合成表型(去分化表型)標志基因的表達量。這些結果表明流體切應力可誘導大鼠的VSMCs發生表型轉化，并且具有一定的時間依賴性。然而，流體切應力對大鼠VSMCs表型的調控是否與自噬相關，有待進一步探討。

自噬是細胞在自噬相關基因(Autophagy related gene,ATG)的調控下利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子的過程，在維持細胞內穩態中扮演重要角色[11]。先前的研究報道顯示誘發血管疾病的刺激物和應激源可以激活自噬過程，進而導致VSMCs表型和功能發生改變[12]。其次多數生長因子被證實為VSMCs表型轉化的重要調控因子，其部分通過調節自噬活性實現[13]。本研究在VSMCs暴露切應力刺激后的不同時間點檢測自噬相關蛋白LC3和Beclin-1的表達，其各時間點LC3和Beclin-1表達的上調證實流體切應力可激活VSMCs自噬。盡管多數研究已證明VSMCs自噬在再狹窄、動脈粥樣硬化和高血壓血管壁中被激活，但是自噬在血管健康和疾病中作用尚不明確。本研究發現流體切應力沖擊可增強體外培養大鼠VSMCs的自噬水平，進一步應用自噬抑制劑3-MA與Rapa探討自噬在流體切應力誘導的VSMCs表型轉化中的作用。結果顯示自噬抑制劑可以部分逆轉VSMCs的表型轉化，與之相反，自噬激動劑可以進一步促進切應力刺激下VSMCs表型轉化。據報道血小板源性生長因子(Platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)可快速誘導VSMCs由收縮表型向合成表型轉化，值得注意的是PDGF-BB可增強VSMCs自噬水平，激活自噬可清除收縮蛋白與被脂質親電試劑損傷的蛋白[14,15]。依據本實驗結果及相關文獻我們推斷流體切應力可通過激活自噬誘導大鼠VSMCs的表型轉化。

綜上所述，本研究通過系列實驗證實流體切應力可誘導體外培養大鼠VSMCs表型轉化，深入探討其相關分子調控機制發現流體切應力通過激活自噬調控VSMCs表型轉化。本研究深化了對IAs形成、發展及破裂機制的理解，為IAs的早期診斷及藥物治療提供可能的分子靶點。目前對流體切應力激活自噬過程中所涉及的分子信號通路尚不清楚，這將是本課題組下一步的研究目標。