S1PR1基因慢病毒轉染對EAE小鼠調節性T細胞及IL-17、IFN-γ水平的影響

張 瑤 李作孝

(西南醫科大學附屬醫院，瀘州646000)

多發性硬化癥(Multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經系統(Central nervous system,CNS)自身免疫性炎癥性疾病，其病理特征為慢性炎性脫髓鞘，星型膠質細胞反應性增殖，常伴有不同程度的軸突受損，目前MS的病因及發病機制尚未明確，研究表明MS可能是由遺傳因素和環境因素相互作用引發的免疫失調引起[1]。臨床上常用于MS的治療藥物包括大劑量甲潑尼龍沖劑治療，免疫調節治療(如β-干擾素、芬戈莫德)等，其中芬戈莫徳(FTY-720)在2010年9月成為首個被美國食品與藥品管理局(FDA)批準用于治療復發型多發性硬化癥(Relapsing-remitting multiple sclerosis,RRMS)的口服免疫抑制劑，FTY-720在MS的治療中的主要機制是在體內磷酸化后，作為1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)受體調節劑，通過與T淋巴細胞表達的鞘氨醇-1-磷酸1型受體(Sphingosine-1-phosphate receptor 1)結合，促使外周循環中T淋巴細胞歸巢，以減少T淋巴細胞在中樞神經系統(CNS)中的破壞性浸潤[2]。大量研究表明S1P/S1PR1信號通路在T淋巴細胞成熟、歸巢以及遷移中具有核心作用[3]。因此以S1P/S1PR1信號通路上下游為靶向目標的藥物研究也是目前的熱點。本實驗選用病理特征、生化指標、臨床癥狀與MS相似的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠作為動物模型[4]，經外周轉染攜帶目的基因S1PR1的慢病毒(LV-S1PR1)，通過觀察小鼠臨床癥狀、脾臟中調節性T細胞比例及脊髓組織中炎癥因子表達的水平，探討外周轉染LV-S1PR1對EAE小鼠發病的影響及產生該影響可能的機制，期望為S1P/S1PR1信號通路中靶向藥物的研發提供實驗依據及新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康雌性C57BL/6小鼠30只,購自重慶騰鑫生物技術有限公司,生產許可證號為SCXK(渝)2018-0003，周齡介于6～8周，體重16～20 g，所有小鼠飼養于溫度22～26℃，相對濕度 40%～80%，明暗交替12 h的環境中，以潔凈飲水和標準飼料自由飲食，實驗過程符合《實驗室動物飼養和操作條例》。

1.1.2 實驗試劑及儀器 髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55(MOG35-55)(上海吉爾生化公司)，完全弗氏佐劑(CFA)、百日咳毒素(PTX)(美國Sigma公司)，卡介苗(Dfico公司)，S1PR1基因慢病毒(LV-S1PR1)(上海吉凱基因化學技術公司，合同編號GCPL0142868)，兔抗鼠S1PR1抗體、兔抗鼠GAPDH抗體(英國Abcam公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔抗體(美國KPL公司)，S1P、IFN-γ、IL-17 ELISA檢測試劑盒(武漢科鹿生物科技有限責任公司)，APC-CD3、PE-CD4(美國Biolegend公司)；臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)，流式細胞儀(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組、EAE模型建立及LV-S1PR1轉染方法 將30只C57BL/6雌性小鼠隨機分為空白對照組、EAE模型組及LV-S1PR1轉染組，每組各10只。EAE模型組及LV-S1PR1轉染組小鼠采用MOG35-55多肽免疫法制備EAE模型，用PBS(0.01 mol/ml，pH7.2)將抗原MOG35-55稀釋為3 mg/ml，加入等體積完全弗氏佐劑(CFA)，其中卡介苗的濃度為10 g/ml，用注射器于冰上持續抽打乳化至油包水狀態，在小鼠脊柱兩側、頸部、蹊部四個點皮下注射抗原乳劑0.2 ml/只，免疫后0 h及48 h腹腔注射百日咳毒素(PTX)500 ng/只，對照組注射同等體積生理鹽水。以免疫當天為第0天，免疫后第3天LV-S1PR1轉染組10只小鼠通過尾靜脈注射LV-S1PR1，病毒滴度為8×108TU/ml，10 μl/只，空白對照組及EAE模型組尾靜脈注射同等體積的生理鹽水。

1.2.2 神經功能缺損評分 第0天開始至第28天每日同一時間(上午10:00)由同一人觀察各組小鼠的攝食情況、臨床癥狀，并采用雙盲法進行各組小鼠神經功能缺損評分，0分:不發病，無臨床癥狀；1分:尾部張力降低；2分:尾部麻痹拖地、雙后肢輕微無力；3分:雙后肢嚴重無力；4分:四肢癱瘓；5分:瀕死狀態或發病后死亡。

1.2.3 各組小鼠外周血中S1PR1表達的檢測 第28天，用10%水合氯醛麻醉小鼠后行眼球取血，使血液自然流出以防止凝血，加入冷卻的PBS緩沖液低速離心收集細胞沉淀，依次加入蛋白酶抑制劑、細胞總蛋白提取試劑后冰浴30 min，再次離心收集上清，完成外周血懸浮細胞總蛋白提取，使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定蛋白質樣品的濃度，進行SDS-PAGE電泳，電泳后轉移到PVDF膜上，將轉好的膜加入封閉液室溫封閉1 h后加入1∶1 000稀釋的一抗(兔抗鼠S1PR1)4℃過夜，回收稀釋的一抗并用TBST洗3次，加入1∶5 000稀釋的二抗(HRP標記的山羊抗兔IgG)，室溫孵育30 min后用TBST在搖床上洗4次，將新鮮配制的ECL混合溶液滴在膜的蛋白面側，于暗室中曝光，進行化學發光和成像，用 Alpha Ease FC 軟件處理系統分析目標帶的光密度值。使用GAPDA作為內參，蛋白的相對表達量用目的蛋白S1PR1 OD/GAPDH OD表示。

1.2.4 各組小鼠外周血中S1P水平的檢測 用1.5 ml 滅菌EP管收集1.2.3中各組小鼠血液樣本，室溫放置1 h待血液凝固后，4℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上層血清，-20℃保存備用。按照ELISA試劑盒說明書的操作檢測各組小鼠外周血中S1P的水平。

1.2.5 各組小鼠脊髓組織中IL-17、IFN-γ水平的檢測 完成眼球取血后的小鼠立即斷頭處死，在冰盤上快速分離脊髓組織，將分離得到的脊髓組織凍于液氮保存、備用。按照ELISA試劑盒說明書的操作檢測各組小鼠脊髓組織中IL-17、IFN-γ水平。

1.2.6 各組小鼠脾臟中調節性T細胞的比例測定 分離取出小鼠脾臟，于細胞篩上碾碎、研磨，離心后制成單細胞懸液，每個流式樣管中收集1×106個細胞，加入APC-CD3、PE-CD4抗體標記細胞，4℃避光保存孵育30 min后向管中加入200 μl PBS后上機，用流式細胞儀進行檢測，并用FlowJo軟件分析數據。

2 結果

2.1 各組小鼠神經功能缺損癥狀評價 如圖1所示，正常對照組小鼠未發病，飲食活動正常，體重持續增加。EAE模型組和LV-S1PR1轉染組小鼠均不同程度的發病，免疫后10 d開始，EAE組和LV-S1PR1轉染組小鼠開始出現體重減輕、精神萎靡、活動減少；12 d開始，EAE組和LV-S1PR1轉染組小鼠陸續發病，主要表現為尾部張力下降、單側后肢無力，以上癥狀在15～26 d加重，逐漸開始出現尾部拖地、一側肢體癱瘓或四肢癱瘓，甚至出現瀕死狀態；而LV-S1PR1轉染組小鼠在18～24 d上述神經功能缺損癥狀評分較EAE組下降，EAE模型組和LV-S1PR1轉染組小鼠發病的潛伏期、進展期的比較以及發病高峰期神經功能缺損評分結果見表1。

2.2 各組小鼠外周血中S1PR1表達水平的比較 使用GAPDA作為內參，空白對照組、EAE模型組、LV-S1PR1轉染組小鼠外周血中S1PR1的相對表達量S1PR1/GAPDH分別為0.57±0.07、0.08±0.01、0.32±0.08。EAE模型組小鼠外周血中S1PR1蛋白相對表達量低于空白對照組(P<0.05)，低于LV-S1PR1轉染組(P<0.05)；LV-S1PR1轉染組小鼠外周血中S1PR1蛋白相對表達量低于空白對照組(P<0.05)，高于EAE模型組(P<0.05)。見圖2。

2.3 各組小鼠外周血中S1P水平的比較 空白對照組、 EAE模型組、LV-S1PR1轉染組小鼠外周血中S1P的水平分別為(26.62±6.15)、(90.77±11.3)、(55.31±7.87)ng/ml。EAE模型組小鼠外周血中S1P的水平高于空白對照組(P<0.05)，高于LV-S1PR1轉染組(P<0.05)；LV-S1PR1轉染組小鼠外周血中S1P的水平高于空白對照組(P<0.05)，低于EAE模型組(P<0.05)。

圖1 神經功能缺損評分變化示意圖Fig.1 Schematic diagram of changes in neurological deficit scores

2.4 各組小鼠脊髓組織中IL-17、IFN-γ水平的比較 如表2所示，EAE模型組小鼠脊髓組織中炎癥因子IL-17、IFN-γ水平均高于空白對照組(P<0.05)，高于LV-S1PR1轉染組(P<0.05)；LV-S1PR1轉染組小鼠脊髓組織中IL-17、IFN-γ水平均高于空白對照組(P<0.05)，低于EAE模型組(P<0.05)。

2.5 各組小鼠脾臟中調節性T淋巴細胞比例的檢測 空白對照組、EAE模型組、LV-S1PR1轉染組小鼠脾臟中調節性T淋巴細胞所占比例分別為(44.03±2.45)%、(64.87±2.81)%、(53.13±2.94)%。EAE模型組小鼠脾臟中的調節性T淋巴細胞比例高于空白對照組(P<0.05)和LV-S1PR1轉染組(P<0.05)；LV-S1PR1轉染組小鼠脾臟中的調節性T細胞比例高于空白對照組(P<0.05)，低于EAE模型組(P<0.05)。見圖3。

GroupsIncubationperiod(d)Progressperiod(d)Neurologicaldeficit scores inpeak onset periodEAE model group10.10±1.2010.00±1.163.13±0.33LV-S1PR1 transfection group15.80±1.691)7.50±1.431)2.03±0.311)

Note：Compared with EAE model group，1)P<0.01.

圖2 各組小鼠外周血中S1PR1表達水平的比較Fig.2 Comparison of S1PR1 expression levels in peripheral blood of mice in each groupNote: A.Blank control group;B.EAE model group;C.LV-S1PR1 transfection group.

GroupsIL-17(pg/ml)IFN-γ(pg/ml)Blank control group26.46±0.7520.86±2.68EAE model group64.05±0.951)47.49±2.071)LV-S1PR1 transfection group41.36±2.271)2)27.53±2.31)2)F814.311172.204P<0.001<0.001

Note：Compared with blank control group，1)P<0.05；Compared with EAE model group，2)P<0.05.

圖3 各組小鼠脾臟中調節性T淋巴細胞流式細胞圖Fig.3 Flow cytometry of regulatory T lymphocytes in spleens of mice in each groupNote: A.Blank control group;B.EAE model group;C.LV-S1PR1 transfection group.

3 討論

MS的病因及具體發病機制至今尚未明確，但大量的研究已經證實，在T淋巴細胞介導下中樞神經系統(Central nervous system,CNS)發生慢性炎性脫髓鞘改變是MS的主要發病機制[5]。隨著進一步研究，發現T淋巴細胞從淋巴器官、外周循環逐級遷移至CNS，最終介導CNS炎癥反應發生，這一復雜過程中，S1P濃度梯度以及S1P/S1PR1之間的相互作用發揮著核心作用[3]。S1P是一種重要的內源性磷脂分子[6]，在體內經鞘氨醇激酶1～2(Sphingosine kinase 1-2,SPHK1-2)磷酸化后生成，S1P通過與五種G蛋白偶聯受體(S1PR1～S1PR5)結合，在免疫系統、中樞神經系統和心血管系統的正常生理和相關疾病發展過程中具有重要的調節功能[7-11]，而S1PR1表達于內皮細胞、淋巴細胞、星型膠質細胞等。由于外周循環中的細胞缺乏1-磷酸鞘氨醇磷酸酶(S1P phosphatase,S1Pase)和1-磷酸鞘氨醇裂解酶(S1P lyase)兩種降低S1P濃度水平的酶，因此外周循環中有著較高的S1P水平，造成胸腺、脾臟以及其他次級淋巴器官與外周循環之間存在著S1P水平梯度[12]。在MS的發病過程中，T淋巴細胞表面表達的S1PR1受到外周循環中高濃度水平的S1P吸引，由淋巴組織向外周循環逐漸遷移至CNS，最終介導炎癥反應的發生。由于S1P/S1PR1信號通路在免疫系統疾病中發揮著重要生物學效應，目前選擇性S1PR1調節劑、SPHK抑制劑和 S1P裂解酶抑制劑等多種以S1P/S1PR1信號通路上下游為靶向目標的藥物正在研發過程中，以S1PR1調節劑的研究較為多見，而對于外周循環中總細胞S1PR1表達上調對EAE小鼠發病的影響及其作用機制的研究尚無報道，本實驗經EAE小鼠尾靜脈轉染攜帶目的基因S1PR1的慢病毒，通過觀察EAE小鼠的臨床癥狀、脾臟調節性T細胞的比例及脊髓組織炎癥因子的表達水平，初步探討S1PR1基因轉染對EAE小鼠發病的影響及其可能的機制。

本實驗結果顯示，LV-S1PR1轉染組小鼠與EAE模型組小鼠相比較，LV-S1PR1轉染組小鼠發病的潛伏期延長，進展期縮短，LV-S1PR1轉染組小鼠發病高峰期時神經功能缺損評分較EAE模型組降低，提示外周轉染LV-S1PR1對EAE小鼠的發病有防治作用。已有實驗表明，在SPHK缺陷小鼠的血中不能檢測到S1P的存在，外周血與胸腺之間的S1P濃度梯度改變，T淋巴細胞從胸腺遷出的過程嚴重受阻，當SPHK缺陷小鼠獲得野生型小鼠骨髓后，外周血中S1P水平恢復，T淋巴細胞重新獲得遷出胸腺的能力[13]。雖然目前T淋巴細胞從胸腺以及脾臟遷出的具體動力學過程尚未明確，但基于已有的實驗結果可知外周血與淋巴器官之間的S1P濃度差是T淋巴細胞向外周遷移的必要條件。本實驗觀察到，LV-S1PR1轉染組小鼠外周循環中S1PR1表達高于EAE模型組，而LV-S1PR1轉染組小鼠外周血中S1P水平較EAE模型組小鼠降低，其機制可能是由于LV-S1PR1轉染組上調了外周循環中S1PR1的表達，S1PR1與S1P結合，從而使S1P水平下降。同時，LV-S1PR1轉染組小鼠脾臟中調節性T細胞比例較EAE模型組降低，其主要機制可能是LV-S1PR1轉染組小鼠外周血S1P水平較EAE模型組降低，使外周循環與淋巴器官之間S1P濃度差減小，導致T淋巴細胞遷出胸腺向外周循環遷移的過程受阻，最終LV-S1PR1轉染組小鼠脾臟中調節性T細胞比例下降。而調節性T淋巴細胞中CD4+T細胞在炎癥反應及自身免疫疾病中發揮重要的生物學效應，CD4+T細胞可以分化為Th1、Th17細胞，而Th1、Th17細胞可以分泌IL-17、IFN-γ等炎癥因子，上述炎癥因子在CNS中可以激活周圍的星型膠質細胞等神經膠質細胞分泌促炎癥因子和趨化因子，使更多的炎癥細胞經血腦屏障進入CNS導致慢性脫髓鞘的發生[14]。已有研究發現，Th17細胞可以直接入侵CNS，主要機制是Th17細胞作用于內皮細胞及小膠質細胞后加速了血腦屏障的破壞[15]。本實驗中，LV-S1PR1轉染組小鼠脊髓組織中炎癥因子IL-17、IFN-γ水平均低于EAE模型組，可能與LV-S1PR1轉染組T淋巴細胞遷移受阻、脾臟調節性T淋巴細胞比例下降，最終減少了IL-17、IFN-γ的釋放有關。

在本實驗中我們觀察到，各組小鼠的神經缺損癥狀的嚴重程度、脊髓組織中炎癥因子的表達水平以及脾臟中調節性T細胞所占比例，都與外周血S1P的水平相關，EAE模型組和LV-S1PR1轉染組小鼠外周血中S1P水平均較正常對照組增高，不同程度地出現神經功能缺損的臨床癥狀，脊髓組織中炎癥因子表達以及脾臟中調節性T細胞比例增高；LV-S1PR1轉染組小鼠外周血中S1P水平較EAE模型組下降，上述觀察指標均有一定程度的改善。此外，有研究發現MS患者腦脊液中S1P水平較正常人增高，提出S1P可能具有較強的促炎活性以及促進星型膠質細胞增生的作用[16]。本實驗中，LV-S1PR1轉染組小鼠S1P水平較EAE組下降，通過減輕LV-S1PR1轉染組小鼠CNS中炎癥反應以及星型膠質細胞反應性增生，最終減輕CNS損傷，可能是外周轉染LV-S1PR1改善EAE小鼠發病的一個重要機制。在T淋巴細胞從胸腺向外周循環、CNS遷移的過程中，T細胞S1PR1的表達以及S1P濃度梯度為兩個必不可少的條件，本實驗通過外周轉染LV-S1PR1，上調外周循環中各細胞S1PR1的表達，一方面，外周中的T細胞S1PR1表達上調，將促進T細胞向CNS遷移，加重CNS炎癥反應；另一方面，外周循環中各細胞增加表達的S1PR1與S1P結合，使循環中S1P水平下降，破壞T細胞向外周循環遷移的初始動力，使T細胞受困于胸腺等淋巴器官，將減輕炎癥細胞在CNS的破壞性浸潤，改善EAE小鼠的臨床癥狀。從本實驗的結果可以得出，在T細胞的遷移過程中，S1P的濃度梯度比T細胞表達S1PR1上調可能發揮更核心的作用，其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，經外周轉染LV-S1PR1后EAE小鼠神經功能缺損癥狀改善，對EAE小鼠的發病具有防治作用，其主要機制可能是通過上調外周循環中S1PR1的表達，結合S1P后使S1P水平下降，打破淋巴器官與外周循環之間S1P濃度差，使T淋巴細胞向外周循環遷移的初始動力減弱、遷移受阻，最終減輕CNS炎癥反應。本實驗觀察到S1P水平在EAE發病過程中的重要生物學效應，使其在MS以及其他自身免疫性疾病中可能成為一種具有巨大潛力的治療靶點，更有望成為評估疾病活動程度、治療進展的一種生物標志物，對S1P/S1PR1信號通路中靶向藥物的研發提供新的思路。