AFP陽性胃癌局部免疫狀況的初步研究

楊 建 周業江

(西南醫科大學附屬醫院胃腸外科，瀘州646000)

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發病率與死亡率均較高，分別居所有惡性腫瘤的第2位及第3位[1]。近年來針對胃癌治療方案的探索層出不窮，其中胃癌的免疫治療是備受關注的熱點之一。目前認為胃癌等諸多腫瘤的發生、發展與免疫耐受及抗腫瘤免疫水平的下調等有關。AFP+GC作為一種較為罕見的特殊類型胃癌，有研究表明其發病率約占所有胃癌患者的1.3%～15%，具有高度侵襲性、易發生肝臟及淋巴結轉移、總體預后差等特點[2-5]。既然AFP+GC與AFP-GC在臨床預后等特征上具有顯著差異，那么AFP+GC與AFP-GC在局部免疫狀況方面是否存在明顯差異性值得進一步探討。由于AFP+GC發病率低，現階段與AFP+GC相關的研究以案例報告居多，而關于AFP+GC局部免疫狀況的研究尚少見報道。本研究旨在探討2013年12月～2017年12月于西南醫科大學附屬醫院就診并接受手術治療的31例AFP+GC與65例AFP-GC患者在局部免疫狀況上的差異性，以期從局部免疫狀況方面進一步認識AFP+GC，進而為AFP+GC的臨床個體化治療提供更多的理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 采用回顧性分析方法，查閱并收集西南醫科大學附屬醫院胃腸外科2013年12月～2017年12月行胃癌根治術或姑息性切除手術治療，且最終經病理確診的原發性胃癌患者的完整病歷資料。在排除肝硬化、肝炎、妊娠、生殖系胚胎源性腫瘤、原發性肝癌等可能引起AFP升高的疾患后，并按血清AFP>10 ng/ml，初步篩出AFP+GC患者32例，同時隨機篩選出同期手術治療的AFP-GC患者64例，共計96例。并于我院病理科調取相應患者的癌組織石蠟塊，利用石蠟塊通過免疫組化染色(S-P法)進一步劃分AFP+GC與AFP-GC，最終得到AFP+GC患者31例，AFP-GC患者65例，共計96例。①在31例AFP+GC患者中：男18例，女13例；年齡45～74歲，≥60歲 17例，<60歲 14例；腫瘤大小：≥5 cm 18例，<5 cm 13例；組織分化良好(高/中分化腺癌)12例，差(低分化腺癌/未分化癌/黏液腺癌/印戒細胞癌)19例；浸潤深度：T1/T2 8例，T3/T4 23例；淋巴結轉移：有24例，無7例；肝轉移：有15例，無16例；腹膜種植：有9例，無22例；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期 9例，Ⅲ/Ⅳ期 22例(按UICC/AJCC 2010版TNM分期劃分)。②在65例AFP-GC患者中：男41例，女24例；年齡：43～77歲，≥60歲 38例，<60歲 27例；腫瘤大小：≥5 cm 26例，<5 cm 39例；組織分化：良好(高/中分化腺癌)30例，差(低分化腺癌/未分化癌/黏液腺癌/印戒細胞癌)35例；浸潤深度：T1/T2 34例，T3/T4 31例；淋巴結轉移：有36例，無29例；肝轉移：有17例，無48例；腹膜種植：有7例，無58例；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期 36例，Ⅲ/Ⅳ期 29例(按UICC/AJCC 2010版TNM分期劃分)。

1.1.2 實驗材料 所有石蠟標本均連續切片，制成4 μm切片。鼠抗人S-100蛋白單克隆抗體、S-P檢測試劑盒、DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術公司；兔抗人FOXP3多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗人GZMB多克隆抗體購自美國Bioworld技術有限公司。均以PBS代替一抗作為陰性對照，使用試劑公司提供的陽性片作為陽性對照。

1.2 結果判定 S-100+DC的判定標準：以胞漿或胞核中出現棕黃色或淡黃色顆粒為陽性細胞，先在低倍鏡(×100)選取癌細胞密集區，后更換高倍鏡(×400)，計數6個高倍鏡視野內浸潤的總數，計數后取其平均值。

GZMB+CTL及GZMB+NK細胞的判定標準：以胞漿中出現棕黃色或淡黃色顆粒為陽性細胞，先在低倍鏡(×100)選取癌細胞密集區，后更換高倍鏡(×400)，計數6個高倍鏡視野內浸潤的GZMB+CTL及GZMB+NK細胞總數，計數后取其平均值。

Foxp3+Treg的判定標準：以胞核中出現黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞，先在低倍鏡(×100)選取癌細胞密集區，后更換高倍鏡(×400)，計數6個高倍鏡視野內浸潤的Foxp3+Treg總數，計數后取其平均值。

2 結果

2.1 前期通過AFP抗體免疫組化染色對AFP+GC與AFP-GC的復篩結果 在胃癌組織中，AFP陽性顆粒定位于胞漿，圖1A～D分別為AFP的陰性(-)、弱陽性(1+)、陽性(2+)、強陽性(3+)表達，本研究將“1+”、“2+”、“3+”視為陽性表達(即AFP+GC)。

2.2 AFP+GC與AFP-GC腫瘤微環境中的S-100+DC、Foxp3+Treg、GZMB+CTL和GZMB+NK細胞的浸潤情況 AFP+GC腫瘤微環境中的S-100+DC、GZMB+CTL及GZMB+NK細胞數量顯著少于AFP-GC，差異具有統計學意義(P<0.05)，AFP+GC腫瘤微環境中的Foxp3+Treg數量顯著多于AFP-GC，差異具有統計學意義(P<0.05)，詳見表1～3。圖2E、F、G分別為腫瘤微環境中浸潤的S-100+DC、Foxp3+Treg、GZMB+CTL和GZMB+NK細胞。

2.3 AFP+GC與AFP-GC腫瘤微環境中的S-100+DC、Foxp3+Treg、GZMB+CTL和GZMB+NK細胞浸潤水平的分層分析 分層分析發現：①S-100+DC的浸潤水平與淋巴結轉移有關，僅在有淋巴結轉移情況下AFP+GC腫瘤微環境中S-100+DC的浸潤水平顯著低于AFP-GC(P<0.05)；而無論腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、肝轉移、腹膜種植、TNM分期如何，AFP+GC腫瘤微環境中S-100+DC的浸潤水平均顯著低于AFP-GC(P<0.05)。②Foxp3+Treg的浸潤水平與病理分期有關，僅在Ⅲ/Ⅳ期組AFP+GC腫瘤微環境中Foxp3+Treg的浸潤水平顯著高于AFP-GC(P<0.05)；而無論腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、肝轉移、腹膜種植如何，AFP+GC腫瘤微環境中Foxp3+Treg的浸潤水平均顯著低于AFP-GC(P<0.05)。③GZMB+CTL和GZMB+NK的浸潤水平與分化程度、浸潤深度、肝轉移、腹膜種植有關，僅在分化差組、浸潤深度達T3/T4組、無肝轉移組、無腹膜種植組AFP+GC腫瘤微環境中GZMB+CTL和GZMB+NK的浸潤水平顯著低于AFP-GC(P<0.05)；而無論腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期如何，AFP+GC腫瘤微環境中GZMB+CTL和GZMB+NK的浸潤水平均顯著低于AFP-GC(P<0.05)。詳見表4。

圖1 胃癌組織中AFP的表達水平Fig.1 Expression level of AFP in gastric cancer tissuesNote: A.Negative expression of AFP;B.Weak positive expression of AFP;C.Positive expression of AFP;D.Strong positive expression of AFP.

圖2 S-100+DC、Foxp3+Treg、GZMB+CTL和GZMB+NK細胞在腫瘤細胞中的浸潤水平Fig.2 Infiltration levels of S-100+DC,Foxp3+Treg，GZMB+CTL and GZMB+NK cells in tumor microenvironmentNote: A.The S-100+DC in tumor imcroenvironment;B.The Foxp3+ Treg in tumor microvenvironment;C.The GZMB+CTL and GZMB+NK cells in tumor microenvironment.

表1 AFP+GC與AFP-GC腫瘤微環境中的S-100+DC浸潤水平

Tab.1 Infiltration level of S-100+DC in tumor microenvironment of AFP+GC and AFP-GC

GroupsnS-100+DC(n/HPF,x±s)tPAFP+GC317.75±2.026.6290.0001)AFP-GC6511.46±3.43

Note：1)P<0.001.

表2 AFP+GC與AFP-GC腫瘤微環境中的GZMB+CTL及GZMB+NK細胞浸潤水平

Tab.2 Infiltration level of GZMB+CTL and GZMB+NK cells in tumor microenvironment of AFP+GC and AFP-GC

GroupsnGZMB+CTL and GZMB+NK(n/HPF,x±s)tPAFP+GC313.24±1.353.4370.001AFP-GC654.36±1.55

表3 AFP+GC與AFP-GC腫瘤微環境中的Foxp3+Treg浸潤水平

Tab.3 Infiltration level of Foxp3+Treg in tumor microenvironment of AFP+GC and AFP-GC

GroupsnFoxp3+Treg(n/HPF,x±s)tPAFP+GC3114.22±4.345.6780.0001)AFP-GC659.41±2.67

Note：1)P<0.001.

表4 AFP+GC與AFP-GC腫瘤微環境中局部免疫相關細胞浸潤水平的分層分析

Tab.4 Stratified analysis of local immune-related cell infiltration levels in tumor microenvironment of AFP+GC and AFP-GC

ClinicopathologicfactorsAFP(+/-)nS-100+DCtPFoxp3+TregtPGZMB+CTLand GZMB+NKtPTumor size≥5 cmAFP+187.38±1.615.6830.0001)14.87±4.534.7980.0001)3.18±1.352.2390.030AFP-2612.04±3.709.07±2.914.19±1.56<5 cmAFP+138.27±2.462.8650.00613.31±4.063.0710.0083.33±1.412.3430.023AFP-3911.07±3.229.64±2.524.47±1.55Differential degreeHigh+ModerAFP+128.89±1.405.1080.0001)15.25±4.615.3270.0001)3.65±1.191.2180.230AFP-3012.57±3.279.20±2.684.26±1.56LowAFP+197.04±2.054.7450.0001)13.56±4.153.7710.0012.98±1.413.3940.001AFP-3510.51±3.329.58±2.704.44±1.55Depth of infiltrationT1/T2AFP+88.14±1.324.2870.0001)15.38±5.792.9350.0193.89±1.561.2260.227AFP-3411.49±3.669.19±2.944.60±1.47T3/T4AFP+237.62±2.224.8700.0001)13.81±3.794.6380.0001)3.02±1.232.6660.010AFP-3111.43±3.229.65±2.374.09±1.61Lymph node metastasisYesAFP+247.12±1.595.4910.0001)14.02±4.804.1820.0001)3.35±1.482.9300.005AFP-3610.70±3.409.58±2.494.48±1.45NoAFP+79.94±1.881.8980.06614.89±2.294.7890.0001)2.86±0.713.2780.003AFP-2912.40±3.289.20±2.924.20±1.67Liver metastasisYesAFP+157.05±2.202.0730.04715.21±4.223.8680.0013.42±1.651.3650.182AFP-178.75±2.4110.41±2.724.19±1.55NoAFP+168.42±1.646.4500.0001)13.29±4.373.6650.0023.08±1.023.2140.002AFP-4812.42±3.239.05±2.594.41±1.55Peritoneal implantationYesAFP+96.04±1.514.2610.00113.62±3.682.2260.0433.08±1.330.5980.559AFP-710.57±2.719.63±3.393.46±1.15NoAFP+228.45±1.795.2050.0001)14.46±4.644.8520.0003.31±1.383.0510.003AFP-5811.57±3.519.38±2.614.47±1.56TNM stageⅠ/ⅡAFP+98.52±1.724.8830.0001)12.23±4.851.8170.1012.83±1.252.7690.008AFP-3612.48±3.449.17±2.774.39±1.57Ⅲ/ⅣAFP+227.44±2.093.6680.00115.03±3.945.9750.0001)3.14±1.382.1580.036AFP-2910.20±3.029.38±2.564.31±1.54

Note：1)P<0.001.

3 討論

目前國內外學者普遍認為，腫瘤的發生、發展與機體免疫系統的紊亂密切相關。機體免疫功能低下時，若不能及時發現、清除惡性突變的細胞，可導致惡性腫瘤的發生。在惡性腫瘤形成后癌細胞可刺激機體而誘發免疫應答，出現抗腫瘤免疫效應，以清除體內的惡性腫瘤細胞，但惡性腫瘤本身也可通過一系列機制抑制機體的抗腫瘤免疫效應或逃避免疫細胞的攻擊。腫瘤與機體之間的相互作用結果，決定了腫瘤的轉歸。腫瘤微環境作為抗瘤免疫效應的第一戰場，可以更直接地了解機體抗腫瘤免疫的強弱，在抗腫瘤免疫研究中具有重要作用，近年來各種腫瘤的局部免疫狀態已經成為研究的熱點之一。目前，國內外對胃癌的局部免疫狀態的研究已不少，但對AFP+GC的局部免疫狀態的研究尚缺乏。

DC是目前發現的效力最強的抗原提呈細胞(Antigen presenting cells，APC)，且髓系DC是唯一能夠特異性啟動初始T細胞介導的細胞免疫的APC[6，7]。目前已有眾多的研究表明，腫瘤微環境中DC的水平與患者的預后密切相關，腫瘤微環境中DC的浸潤水平越高，腫瘤患者的預后往往越好。此外，也有研究認為腫瘤患者的預后除與腫瘤微環境中的DC浸潤水平有關外，還與DC的功能狀態有關[8-12]。國外有研究者發現胃癌患者腫瘤微環境中的DC浸潤水平與患者的淋巴結轉移情況、生存時間有一定的關系，DC浸潤水平越高，患者的生存時間越長[13-15]。除此之外，也有文獻報道前列腺癌、乳腺癌、子宮內膜癌、結直腸癌中DC的浸潤水平與患者的預后有關[12，16-19]。本研究結果表明，AFP+GC腫瘤微環境中的S-100+DC浸潤水平低于AFP-GC，提示在AFP+GC中腫瘤浸潤樹突狀細胞所表現出的正向免疫調節能力可能弱于AFP-GC，這可能是AFP+GC整體預后較AFP-GC差的免疫學原因之一。此外，本研究還發現腫瘤微環境S-100+DC浸潤水平與淋巴結轉移存在一定關系，但具體關系及可能的關聯機制尚不清楚仍需進一步研究予以證實及闡明。

FOXP3是Treg的標志性分子，對中樞及外周淋巴器官中Treg的發育和功能具有重要作用[20]。Foxp3+Treg可通過產生TGF-β、IL-10、IL-35來抑制DC和效應T細胞，進而維持機體的免疫自穩，在食物抗原的口服耐受及共生菌的正常定植中具有重要作用[21]。隨著研究的深入，發現Foxp3+Tregs的免疫抑制作用參與了腫瘤的免疫耐受，影響著腫瘤的免疫治療及預后。本研究結果顯示AFP+GC腫瘤微環境中的Foxp3+Treg浸潤水平顯著高于AFP-GC，提示AFP+GC可能較AFP-GC更易出現免疫耐受，這也可能是AFP+GC的預后較AFP-GC差的免疫學原因之一。此外，分層分析發現在分期較晚的胃癌患者中，AFP+GC較AFP-GC腫瘤微環境中的Foxp3+Treg浸潤水平更高，但具體原因有待進一步研究予以闡明。

GZMB的表達是細胞毒細胞活化的標志，GZMB主要由CTL和NK細胞產生,也可由少數非淋巴細胞產生[22]。已有較多的研究表明，腫瘤微環境中浸潤的CTL和NK細胞密度與抗腫瘤免疫強弱有關，CTL和NK細胞浸潤水平越高，則患者的抗腫瘤免疫能力越強，預后可能越好[23-26]。本研究結果表明，AFP+GC腫瘤微環境中的GZMB+CTL及GZMB+NK細胞浸潤水平低于AFP-GC，提示在AFP+GC中以CTL、NK細胞為代表的正向免疫調節能力可能弱于AFP-GC，這也可能是AFP+GC整體預后較AFP-GC差的免疫學原因之一。此外，分層分析發現在AFP+GC與AFP-GC間，腫瘤微環境中GZMB+CTL及GZMB+NK細胞的浸潤水平還與分化程度、浸潤深度等病理因素有一定關系，但具體關聯機制尚不清楚。

本研究發現AFP+GC與AFP-GC在局部免疫狀況方面存在明顯的差異性，雖然導致此差異性的具體分子機制目前尚不清楚，但這一發現既可以從免疫學層面上對AFP+GC臨床預后差的原因做出一定程度的解釋，也為臨床針對AFP+GC進行個體化治療提供了免疫學理論依據。目前與DC有關的免疫治療方案，如DC疫苗已經應用于臨床，并已經在前列腺癌、黑色素瘤及結腸癌中取得了較好的療效[27-29]，目前在胃癌、腎癌、肝細胞癌的臨床試驗中也初見成效[27，30-32]。而針對Treg的治療主要包括[33]：①通過阻斷免疫檢查點而降低Treg的抑制功能；②抑制原位誘導Treg的產生；③阻止Treg向癌巢遷移。有文獻報道針對Treg的治療已經在腎細胞癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤中取得一定的療效[34-37]。基于CTL的腫瘤免疫治療方法已經在動物模型中取得了一定療效[38]。因此，對AFP+GC的局部免疫狀況進行探討，可以從局部免疫狀況層面進一步認識AFP+GC，并為AFP+GC患者的臨床個體化治療提供免疫學依據，以期改善AFP+GC患者的臨床預后。