花鱸魚腸道中產細菌素糞腸球菌的篩選和抑菌效果研究

沈勇，劉文茹，梅俊*，謝晶*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心(上海海洋大學)，上海，201306)3(上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺(上海海洋大學)，上海，201306) 4(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海，201306)

近年來，食品安全問題在全球已經成為備受關注的問題，水產品由于其豐富的營養價值在全球范圍內都很受歡迎[1-2]，但同時也由于其營養成分有利于腐敗微生物和常見的食源性疾病病原體的生長和繁殖，海產品的安全和營養價值在貯藏和運輸的過程比肉類等其他食品下降更快[3-7]。目前，化學防腐劑是延長貨架期的主要手段之一，但由于消費者對化學添加劑的擔憂，要求食品工業在保證產品的質量的同時，少添加甚至不添加化學防腐劑，使用更多的天然防腐劑來保證食品的安全[8-11]。

微生物能夠產生具有抑菌性代謝產物，可以作為生物防腐劑抑制腐敗菌和致病菌的生長，從而達到延長食品貨架期和提高食品安全性的目的[12-13]。乳酸菌通常被認為是安全的微生物(generally regarded as safe,GRAS)，在代謝中可產生有機酸、H2O2、細菌素等多種抑制性化合物[14-16]。乳酸菌生產的細菌素是由核糖體合成的蛋白質化合物，能夠抑制多種微生物，已被證明可有效地控制病原菌和腐敗菌的繁殖[17-20]。乳酸鏈球菌素是目前市場上最重要的、也是唯一商業化的細菌素，作為一種安全、天然的食品防腐劑已被50多個國家用作食品防腐劑[14]。

在過去的研究中，從不同食物中分離出產細菌素的乳酸菌及細菌素的表征進行了廣泛的研究，然而關于魚類產品中存在的乳酸菌的研究較少[21]。為了延長水產品的貨架期，提高其品質，選用屬于水產品及其加工環境中存在的乳酸菌微生物群是有利的方法，因為它們已經適應這些環境，同時也不易產生一些新的氣味[22]。因此本研究旨在從花鱸魚腸道中分離出抑菌性較強的產細菌素乳酸菌，為水產品保鮮和天然防腐劑的開發應用提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

花鱸魚購買于上海蘆潮港水產品市場，0.5 h內低溫運輸至實驗室。解剖時體表完好，腸道完整，無明顯食糜。

1.1.2 主要試劑及培養基

乳酸菌成套生化鑒定管、H2O2、革蘭氏染色液試劑盒、MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基、腦心浸液肉湯(BHI)、平板計數瓊脂(PCA)，青島高科園海博生物技術有限公司；過氧化氫酶、胰蛋白酶、蛋白酶K購自生工生物工程(上海)股份有限公司；胃蛋白酶、溴甲酚紫，國藥集團化學試劑有限公司；細菌DNA基因組提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 指示菌

MGHY1、 MGHY2、MGHY3、MGHY4、MGHY5、MGHY6、MGHY7、MGHY8、MGHY9、MGHY10、MGHY11、MGHY12、MGHY13、MGHY14、MGHY15、MGHY16、MGHY17均分離自美國紅魚(經16s鑒定后，通過NCBI比對，其最相似菌見表1)，金黃色葡萄球菌(CMCC(B) 26003)、金黃色葡萄球菌(CCTCC AB 91093)、金黃色葡萄球菌(實驗室保存)、大腸桿菌O157:H7(ATCC 43889)、大腸桿菌(實驗室保存)、腐敗希瓦氏菌模式菌株(DSM6067)、腐敗希瓦氏菌(分離自凡納濱對蝦)、熒光假單胞菌(ATCC13525)、熒光假單胞菌(分離自三文魚)、單核細胞增生李斯特菌標準菌株(ATCC19115)、植物乳桿菌，上述菌株均由上海海洋大學食品學院保存。

表1 美國紅魚中的分離菌株Table 1 Bacterial isolates from red drum

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化與初篩

參照董韓博等[23]的方法對乳酸菌進行分離純化。無菌環境下取出花鱸魚腸道，用手術剪刀充分剪碎，加入含有25 mL的無菌生理鹽水中重復充分振蕩搖勻，制成原液，吸取1 mL用作稀釋梯度。取原液和10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六個稀釋梯度涂布于添加了溴甲酚紫的MRS固體培養基中，在30 ℃培養48～72 h，挑取能夠使平板由紫色變為黃色的單菌落，再在添加了溴甲酚紫的MRS平板上劃線分離純化，劃線培養3～4次直至純化。

挑單菌落于MRS肉湯培養基中，在30 ℃下培養18 h，再以1%接種量至MRS肉湯培養基中擴大培養，在30 ℃下培養32 h，培養好之后離心(8 000 r/min，20 min) 取上清液，經0.22 μm微孔濾膜除去菌體，得到無細胞上清液，4 ℃保存備用。

利用牛津杯法對乳酸菌進行初篩[24]。在BHI液體培養基中分別接種大腸桿菌O157:H7(ATCC 43889)，30 ℃條件下培養12 h之后，吸取1mL用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，取100 μL稀釋度為10-3的菌液均勻涂布在PCA平板培養基中，再在無菌條件下將牛津杯(內徑6 mm，外徑8 mm)均勻放置在平板上，稍微輕輕下壓，使其與平板培養基接觸面無空隙，然后吸取200 μL發酵液于杯中， 30 ℃下培養18 h，觀察并用游標卡尺測量抑菌圈，挑選抑菌圈最大的乳酸菌株進行后續研究。

1.2.2 產細菌素乳酸菌的復篩

(1)排除有機酸的干擾

在酸性條件下，細菌素的抑菌活性較強，因此為了排除有機酸的干擾，用pH值相同的乳酸和乙酸溶液分別進行抑菌實驗，設3組平行[25]。根據用pH值相同的乳酸和乙酸溶液得出的抑菌圈直徑的大小來判斷是否存在其他抑菌活性物質。

(2)排除H2O2的干擾

用6 mol/L NaOH和6 mol/L HCl溶液將獲得的乳酸菌菌株的發酵液調節至H2O2酶最適的pH值之后，添加過氧化氫酶至終質量濃度為1 g/L，37 ℃下溫育1 h，再將pH值調回原始pH值進行牛津杯抑菌實驗，重復3次，并以未經酶處理的發酵上清液作為對照。若酶解后的上清液抑菌圈未顯著減小，則說明發酵液中存在其他抑菌物質。

(3)蛋白類抑菌物質的確定

用6 mol/L NaOH和6 mol/L HCl將獲得的乳酸菌菌株的發酵液分別調節至胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K的最適pH值(胰蛋白酶8.00、胃蛋白酶2.00、 蛋白酶K 8.00)之后，在37 ℃下溫育1 h，再將pH值調回原始pH值進行牛津杯抑菌實驗，重復3次。并以未經酶處理的發酵上清液作為對照。若酶解后的上清液抑菌圈顯著減小，則說明抑菌物質為蛋白類。

1.2.3 菌株的鑒定

(1)生理生化鑒定

根據乳酸菌成套生化鑒定管試劑說明書對菌株進行生理生化鑒定。

(2)16S rDNA鑒定

將乳酸菌菌株用MRS肉湯培養基活化之后，培養至對數期，使用細菌DNA基因組提取試劑盒提取乳酸菌的基因組DNA。利用提取的乳酸菌基因組DNA為模板，采用擴增細菌16S rDNA的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)，對乳酸菌的16S rDNA進行PCR擴增，得到的PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行測序。

(3)系統發育樹構建

將測序所得的基因序列在GenBank數據庫中進行BLAST同源性比對分析，利用MEGA5.1軟件構建系統發育樹。

1.3 抑菌譜的測定

采用牛津杯法測定產細菌素乳酸菌的抑菌譜，利用1.1.3中的菌體作為指示菌。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離與初篩

從花鱸魚的腸道中，共分離出18株革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的疑似乳酸菌菌株。將初篩得到的菌株，以大腸桿菌O157:H7(ATCC 43889)為指示菌，用牛津杯法進行抑菌發現，編號為HL7的疑似乳酸菌菌株對大腸桿菌O157:H7(ATCC 43889)的抑菌圈明顯。因此，選用HL7為后續研究菌株。

2.2 產細菌素乳酸菌的復篩

乳酸菌在發酵過程中可產生有機酸、H2O2、細菌素等多種抑制性化合物，通過用pH值相同的乳酸和乙酸溶液以及經過氧化氫酶處理的發酵液的抑菌直徑與未經過處理的發酵液抑菌直徑進行比較來判斷HL7菌株為產生細菌素菌株。由表2可見，與發酵液相同pH值的乳酸和乙酸溶液沒有抑菌作用，由此可判斷發酵液中的抑菌物質不是有機酸。酸排除試驗之后，經過氧化氫酶處理的發酵液抑菌性僅僅下降10%，所以H2O2不是主要的抑菌物質。用胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K處理發酵液進行抑菌性實驗發現，經胰蛋白酶處理的發酵液抑菌圈未明顯減小，但經胃蛋白酶和蛋白酶K處理之后的發酵液沒有抑菌性，由此可以推測該抑菌物質雖然對胰蛋白酶不敏感，但對胃蛋白酶和蛋白酶K敏感，依然可初步確定為蛋白類物質。

表2 不同處理發酵液的抑菌活性Table 2 The antibacterial activity of the fermentation broth under different treatments

注：“-”表示未顯示抑菌圈。

2.3 菌株的鑒定

根據乳酸菌成套生化鑒定管試劑說明書對該菌株進行生化鑒定，其生化鑒定結果見表3。由表3可知該菌株能夠發酵七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、菊糖、乳糖，不能利用棉子糖和馬尿酸鈉。該結果表明該菌株可以發酵多種糖，符合乳酸菌的特性；而七葉苷水解實驗為陽性也初步判定該菌株為腸球菌[26]。

表3 生化鑒定結果Table 3 Results of biochemical identification

將HL7菌株利用細菌DNA基因組提取試劑盒提取乳酸菌的基因組DNA之后，進行16S rDNA的PCR擴增之后進行測序，將測序結果在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行序列相似性比對，根據序列〗的比對結果，利用MEGA5.1軟件構建該菌株的系統發育樹。由圖1可知,HL7和EnterococcusfaecalisTY1(CPO31027.1)菌株在同一分支上，序列相似性達到99%，因此該菌株命名為EnterococcusfaecalisHL7。

圖1 菌株HL7根據16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of HL7 constructed based on 16S rDNA sequence analysis

2.4 菌株的抑菌譜

為驗證該菌株在海產品保鮮上的適用性，利用多種來源于海產品的腐敗菌和致病菌作為指示菌，采用牛津杯法檢測EnterococcusfaecalisHL7發酵上清液的抑菌譜。其結果表明該發酵上清液能有效抑制多種腐敗菌和致病菌，在海產品保鮮上具有很大潛力，抑菌結果見表4。

表4 HL7發酵上清液的抑菌譜Table 4 Inhibition spectrum of fermented supernatant of HL7

注: “ - ”表示無抑菌性; “ + ”表示抑菌圈直徑< 10 mm; “ + + ”表示抑菌圈直徑 10～15 mm; “ + + + ”表示抑菌圈直徑 15～20 mm；“ + ++ + ”表示抑菌圈直徑> 20 mm。

3 結論

經過對樣本中的乳酸菌進行初篩和復篩，本研究從花鱸魚腸道中分離得到1株乳酸菌經16S rDNA分子鑒定并建立系統發育樹，鑒定為Enterococcusfaecalis。通過排除有機酸和H2O2的干擾以及蛋白酶敏感實驗，可以確定抑菌物質為蛋白類活性物質。根據該菌株發酵液抑菌譜試驗，發現其發酵液對多種來源于海產品的腐敗菌和致病菌具有抑制作用，為其作為海產品生物保鮮提供了有力的支持。此外，對于Enterococcusfaecalis的細菌素還需要進一步的研究，利用合適的方法將該細菌素進行分離純化研究其結構特征。