急性冠脈綜合征冠脈血微粒內microRNA研究

袁玉娟 祖麗批亞·艾力 穆葉賽·尼加提

隨著經濟發展、人口老齡化以及糖尿病和肥胖的全球發生率增加，動脈粥樣硬化性心血管疾病的發生率將逐年升高。2017年中國心血管病報告中指出中國心血管病(cardiovascular disease, CVD)發生率呈持續上升階段，推算CVD現患人數2.9億，其中冠心病1100萬，心力衰竭450萬[1]。美國心臟協會統計，每年約有250萬人因急性心肌梗死住院，其中平均年齡>40歲的人群中約有18%的女性和23%的男性在被診斷為心肌梗死后一年內死亡[2]。動脈粥樣硬化是一種進行性疾病，冠狀動脈粥樣硬化伴有腔內血栓的形成占急性心肌梗死(acute myocardial infraction, AMI)病例的80%[3]。

研究發現急性心肌梗死的動脈粥樣硬化斑塊的發病機制與脂質代謝紊亂、炎性反應、細胞間信號異常、內皮損傷、血小板激活、凝血酶生成、斑塊破裂、血栓形成等多種因素密切相關[4]。除血小板和血液成分，局部血流動力學或動脈粥樣硬化斑塊成分參與調節動脈血栓形成，隨著心血管領域血栓形成分子生物學機制的深入研究，發現來自內皮細胞、紅細胞、單核細胞、平滑肌細胞和血小板的微粒在動脈粥樣硬化的過程中扮演著重要的角色[5]。

微粒是細胞膜磷脂酰絲氨酸由細胞內層進入外層，以出芽的方式形成小泡狀結構從細胞膜脫落，從而形成的磷脂囊泡，其直徑在0.1～1.0μm。微粒來源包括血小板、白細胞、紅細胞和內皮細胞，它的數量完全取決于各種刺激比如細胞的激活或者凋亡[6,7]。1967年Haematol等首次發現微粒當時被描述成一種細胞碎片[8]。現在越來越多的研究證明，微粒可作為很多系統疾病診斷及治療的生物學標志物，包括心血管系統疾病、神經系統疾病和腫瘤疾病[9,10]。

前期研究發現急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)患者的外周血微粒水平明顯升高，其中紅細胞源微粒、血小板源微粒以及內皮細胞源微粒參與 ACS 的發生、發展過程。在體外將ACS患者血漿中提取的不同濃度紅細胞源微粒和血小板源微粒加入非冠心病患者血漿中，發現微粒誘導血栓形成的峰值前移，提示紅細胞源微粒和血小板源微粒可能誘導凝血酶形成，從而證實 ACS 發生急性血栓與紅細胞源、血小板微粒相關性[11～16]。

在微粒形成過程中，攜帶有來源母細胞的膜蛋白及胞內溶質分子，且發現在不同刺激因素調控下細胞釋放的微粒所攜帶物質和含量不盡相同，使其可作為反映疾病狀態的生物學標志物，同時微粒攜帶的表面抗原表型分子也可作為其分類篩選的依據。循環中微粒通過微粒表面蛋白與靶細胞表面蛋白識別并結合，激活靶細胞信號轉導通路，從而對靶細胞進行調節，或者通過進入靶細胞內釋放微粒所攜帶的蛋白質、mRNA、microRNA等物質調控靶細胞的功能狀態[17]。

近年來循環血中microRNA作為心血管疾病的生物學標志物引來廣泛關注。大量研究表明非編碼RNA在表觀遺傳學修飾中扮演重要角色，能在基因組水平及染色體水平對基因表達進行調控，決定細胞分化的命運，microRNA在多種生理和病理過程中起關鍵作用，microRNA的功能損害與各種疾病和病理生理學相關[18]。microRNA是高度保守的非編碼小分子RNA，是一類小的核糖核酸片段(約22個核苷酸)，長約21～25nt的單鏈RNA，其中50%定位于易發生結構改變的染色體區域。作為內生翻譯后調節基因，microRNA通過綁定在信使RNA上在反轉錄水平上調節基因表達，從而使信使RNA降解或翻譯，故被看作是心血管生理及病理調節的關鍵[19]。

本研究通過提取冠脈血內微粒，分析所含microRNA表達差異譜，并進行靶基因預測及相應的功能分析，探討微粒作為microRNA的運載體在ACS血栓形成中的作用，為冠狀動脈內血栓形成的分子生物學機制提供理論依據。

材料與方法

1.研究對象:所有納入對象均來自2017年10月～2018年2月，在筆者醫院心內科住院的患者。根據嚴格的納入標準和排除標準最終從42例住院患者篩選出15例納入本研究，所有患者入院時告知研究內容并同時簽署知情同意書。

研究對象分為 AMI 組(n=5)、UAP組(n=5)和穩定型冠心病組(n=5)，收集研究對象的一般資料和心血管疾病相關危險因素，主要包括研究對象的一般資料，包括姓名、性別、體重指數(body mass index，BMI)、年齡、高血壓病、2型糖尿病、吸煙、心臟射血分數、血脂、血糖等。

2.納入標準：①UAP 為近1個月內新發的心絞痛或1個月內心絞痛惡化加重[心絞痛分級至少增加1級，或至少達到Ⅲ級，采用加拿大心血管病學會(Canadian Cardiovascular Society，CCS)分級],以及休息時發作的心絞痛，心電圖有至少兩個相鄰到連出現新的或動態的ST段或T波改變，心臟肌鈣蛋白 T(cTnT)檢查正常;②AMI 為胸痛持續時間>20min,起病在24h內，心電圖有至少兩個相鄰導聯出現ST段抬高或壓低，cTnT>0.1μg/L(正常值<0.05μg/L);③穩定型冠心病為冠狀動脈造影術中診斷冠心病，非急性冠狀動脈綜合征患者，同時需要行支架置入術。

3.排除標準：①嚴重肝腎功能不全；②腫瘤性疾病；③造血系統疾病；④類風濕、系統性紅斑狼瘡和干燥綜合征等自身免疫系統疾病；⑤腦梗死和肺栓塞。

4.樣本收集：(1)冠狀動脈血收集：研究對象行冠狀動脈介入術時經橈動脈入路，術中導管進入冠狀動脈，導絲到達病變部位，球囊進入病變斑塊處，擴張球囊，其大小與病變血管相適，在球囊迅速排氣后抽吸10ml冠狀動脈血，球囊從導絲中撤離。(2)外周血收集：為避免冠狀動脈造影及相關介入治療影響生化指標，所有患者均在冠狀動脈造影前進行外周血采集。標本為入院24h之內患者的外周血，獲得知情同意書后，采集患者肘靜脈血2ml，血常規、血脂等檢測均在清晨空腹靜息狀態下抽取外周血送檢。用檸檬酸鈉抗凝管(美國BD公司)收集。在血液取樣時保證止血帶不應該保持太長時間，從而避免誘導細胞的激活或凋亡。

5.實驗方法：(1)外周血紅細胞源微粒的分離:①血標本以2000×g、室溫下離心15min分離出紅細胞(red blood cell,RBC)、白細胞(white blood cell，WBC)以及部分血小板。用一次性吸管將上清液移入無菌的1.5ml EP(Eppendorf)管中；②在23000×g、4℃離心20min后，棄掉上清液，沉淀物為無血小板的微粒，每管加入200μl磷酸緩沖鹽溶液 PBS(phosphate buffer saline)溶液，連續吹打5min，樣本與PBS溶液充分融合后，標本標明收集日期以及患者入組編號于-80℃保存以便將來使用。(2)RNA的抽提:采用 Qiagen serum/Plasma Kit-Qiagen#217184 并且根據生產廠商提供的標準操作流程進行樣品的total RNA抽提，抽提所得total RNA經NanoDrop ND-2000分光光度計質檢合格后備用。(3)芯片實驗流程:①去磷酸化:使用Agilent′s miRNA complete labeling and hyb kit(p/n 5190-0456)試劑盒中的堿性磷酸酶CIP的作用來去除 RNA5′端磷酸基團；②RNA標記:使用上述試劑盒中的T4 RNA連接酶把Cyanine3-pCp連接到RNA3′端；③芯片雜交:按照Agilent miRNA芯片配套提供的雜交標準流程，在滾動雜交爐中55℃，20×g，滾動雜交20h，并在洗缸中洗片；④芯片掃描:完成雜交的芯片采用Agilent microarray scanner(Cat.# G2565CA, agilent technologies, Santa Clara, CA, US)進行掃描。用Feature Extraction software 10.7 讀取數據，最后采用R軟件包進行歸一化處理。(4)差異基因篩選和結果展示:原始數據經歸一化后，采用fold-change(表達差異倍數)以及t檢驗(Student′st-test)統計學方法對差異基因進行篩選，將篩選得到的不同組間的差異基因，通過散點圖、火山圖及熱圖等方法，進行直觀的圖形展示。(5)靶基因預測和功能分析:采用Target scan數據庫進行靶基因預測，把所預測的miRNA靶基因向GO(gene ontology)數據庫的各個條目(term)映射，計算每個條目的基因數目，然后應用超幾何檢驗，與整個基因組背景相比，篩選在差異表達基因中顯著富集的GO條目，同樣方法通過KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)pathway行富集功能的預測。

結 果

1.ACS組和穩定性冠心病組臨床基本信息和臨床生化指標分析:兩組患者在體重指數、是否合并糖尿病、是否合并高血壓病方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)，AMI和SAP在吸煙方面比較，差異有統計學意義(表1)。

表1 兩組患者臨床基本信息和生化指標比較

AMI.急性心肌梗死; UAP.不穩定型心絞痛；SAP.穩定型心絞痛;NS.差異無統計學意義

2.微粒的鑒定:將離心獲得微粒懸浮在PBS溶液中，于電子顯微鏡觀察微粒的形態結構，可見其雙模結果，直徑為0.1～1.0μm，詳見圖1。

圖1 ACS 外周血電子顯微鏡下微粒

3.差異基因結果：將篩選得到的不同組間的差異基因，通過散點圖(圖2、圖3)、火山圖(圖4、圖5)及聚類熱圖(圖6、圖7)進行直觀的圖形展示。

圖2 急性心肌梗死和穩定型冠心病組差異microRNA 散點圖

圖3 不穩定型心絞痛和穩定型冠心病組差異microRNA 散點圖

圖4 急性心肌梗死和穩定型冠心病組差異microRNA 火山圖

圖5 不穩定型心絞痛和穩定型冠心病組差異microRNA 火山圖

4.差異miRNA靶基因結果富集分析:分別做GO和KEGG分析。通過將差異基因做 GO 富集分析，可以把基因按照不同的功能進行歸類，達到對基因進行注釋和分類的目的，見圖8、圖9。將差達基因進行 KEGG 富集分析，可以把差異有統計學意義的pathway進行富集，有助于找到實驗條件下顯著性差異變化的生物學調控通路，見圖10、圖11。

討 論

動脈粥樣硬化是一種進行性疾病，是世界上心臟衰竭和死亡的主要原因，其病理生理機制涉及脂質代謝紊亂，慢性炎癥和細胞間信號異常等[20]。MicroRNAs已經被廣泛證實在病理性細胞間通訊中起著有效的信號作用，這是動脈粥樣硬化發展的關鍵機制[21]。許多microRNAs調節動脈粥樣硬化、脂質代謝、炎癥等細胞外基質的含量[22]。研究證實，微粒作為miRNA的保護性載體，從而避免被核糖核酸酶降解，微粒內的microRNA不僅代表被釋放的細胞碎片，也是細胞間信號轉導的信使[23]。在心血管疾病患者外周血中的細胞微粒數量明顯增多且其所含microRNA水平也與正常生理狀態下循環系統的微粒microRNA水平比較差異有統計學意義，說明細胞微粒及其攜帶的microRNA在心血管疾病發生、發展和預后過程中起重要作用[24]。

圖6 急性心肌梗死和穩定型冠心病組差異microRNA 聚類熱圖

圖7 不穩定型心絞痛和穩定型冠心病組差異microRNA 聚類熱圖

圖8 急性心肌梗死和穩定型心絞痛組差異基因GO分析

圖9 不穩定型心絞痛和穩定型心絞痛組差異基因GO分析

圖10 急性心肌梗死和穩定型心絞痛組差異基因KEGG分析

圖11 不穩定型心絞痛和穩定型心絞痛組差異基因KEGG分析

研究表明，典型的不穩定型心絞痛和血管造影證實的冠狀動脈疾病患者的循環miR-19b水平明顯高于血管造影陰性的對照患者，并且miR-19b主要被納入內皮細胞源微粒(EMPs endothelial cells microparticles)中以維持循環中穩定的運輸[25]。 EMPs 作為miR-19b在血管內皮細胞和其他細胞間通訊的重要載體。有研究通過小鼠尾靜脈注射含有miR-19b微粒，證實含有miR-19b的微粒促進小鼠頸動脈局部脂肪沉積和炎性反應，從而加劇頸動脈粥樣斑塊的發展過程[26]。Zhang等[27]研究發現，AMI中EMPs水平明顯高于CAD組，表明AMI內皮細胞活化的程度高于CAD，且AMI患者血漿中miR-92a的表達水平高于CAD及對照組。miR-92a 可能與心肌損傷有關，推測內皮細胞來源的 miR-92a 可能被 EMPs 從內皮細胞轉移到心肌細胞，從而對心肌細胞造成損傷。

本研究在冠脈PCI術中抽取急性心肌梗死、不穩定型心絞痛和穩定型心絞痛冠脈血，離心獲得的微粒經過芯片實驗檢測出差異表達microRNA，急性心肌梗死組與穩定型心絞痛組比較，microRNA差異表達基因共8個，其中上調的有hsa-miR-1268b、hsa-miR-4507、hsa-miR-575、hsa-miR-6875-5p、hsa-miR-7704，下調的有hsa-let-7i-5p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-209-3p，不穩定型心絞痛組microRNA差異表達基因18個，上調的有hsa-miR-3656，下調的有phsa-miR-181a-5p、hsa-miR-575、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-342-3p等17個基因。通過Target scan數據庫完成下游靶基因預測，其中急性心肌梗死組靶基因出現較多頻率的有AGO2、GREM14、RHF1847和ZHF7884等，不穩定型心絞痛組有KCHJ6、PRRG3、RHF187等。差異microRNA靶基因結果分別做GO分析進行基因功能分析，通過KEGG分析得到差異有統計學意義的生物學調控通路。其中有意義的生物學途徑急性心肌梗死組中正調控蛋白的同型低聚, 調節IL-12生物合成過程，細胞胞吞作用等，不穩定型心絞痛組中泛素樣蛋白綴合酶活性，泛素結合酶活性，泛素介導的蛋白水解，神經營養印在信號轉導途徑等。

本研究通過冠脈介入術中抽吸冠脈血，獲得冠脈局部血微粒，測定冠脈病變局部血微粒更能反應ACS發生、發展過程中微粒內microRNA變化，從而避免外周血受機體內環境干擾的影響因素，研究結果證實急性心肌梗死組、不穩定型心絞痛組與穩定型冠心病組冠脈血微粒所含microRNA具有明顯差異，同時揭示微粒中microRNA的差異表達譜，提示冠脈血內微粒microRNA可能與ACS發生急性血栓事件相關。目前研究只是初步篩選出ACS患者冠脈血微粒內差異表達microRNA和生物學通路，具體通路機制需后續進行相關動物實驗和臨床試驗進行研究。