基于EGFR-MUC5AC信號通路探討參魚化痰口服液干預慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道黏液高分泌的機制*

李天浩，韓晨旭，王惠琴，任加良，馬建剛

陜西中醫藥大學第二附屬醫院(咸陽 712000 )

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是呼吸系統常見疾病，以慢性、反復加重的咳嗽、咳痰為其主要臨床表現，疾病晚期合并呼吸衰竭、肺心病，危及患者的生命。研究發現，COPD患者氣道黏液分泌明顯增多，即使在疾病緩解期，也處于較高分泌狀態，這種慢性黏液高分泌既是引起慢性咳痰的原因，也使患者更容易發生肺部感染，已成為COPD的獨立危險因素[1-4]。中醫治療COPD具有多靶點、毒副作用少的優點，目前用于臨床的中藥復方制劑并不鮮見。參魚化痰口服液是我院院內制劑，是由清肺化痰逐瘀湯加工而成，應用臨床療效顯著，前期研究表明，可明顯減輕COPD患者咳嗽、咳痰等癥狀，降低COPD 患者血清CRP、IL-6、MMP-9水平，升高 SOD 水平[5-7]。本研究通過觀察參魚化痰口服液對COPD大鼠氣道上皮中杯狀細胞和粘蛋白 MUC5AC表達的影響，探討參魚化痰口服液干預COPD大鼠氣道黏液高分泌的可能作用機制。

材料與方法

1 實驗動物 清潔級、雄性SD大鼠36只，180～220g，購于西安交通大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(陜)2012-003。實驗大鼠分籠飼養，自由飲水進食，適應性喂養3～7 d。本研究符合陜西中醫藥大學實驗動物倫理委員會相關要求并審批通過。

2 實驗試劑 參魚化痰口服液(處方組成為：魚腥草、桑白皮各12 g，丹參20 g，黃芩、杏仁、浙貝母、全瓜蔞、當歸、厚樸各9 g，大黃、水蛭、干姜各3 g，20 ml/支，每支相當生藥1 ml/1 mg)(陜西中醫藥大學第二附屬醫院制劑室)；大前門香煙；脂多糖(LPS)、大鼠MUC5AC單克隆抗體均購于美國Sigma公司；自制1 m3煙熏箱，周圍有1 cm×1 cm通氣孔；MUC5AC免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；Image-Pro Plus圖像分析軟件，美國Media Cybemetics公司。

3 實驗方法

3.1 實驗分組及模型建立：將大鼠隨機分為空白組、模型組、中藥組(參魚化痰口服液組)，每組12只，參照文獻方法[8]建立大鼠COPD模型。將模型組、中藥組大鼠置于1 m3的特制煙室中，每日用鋸末50 g、香煙10支，點燃進行煙熏，每日煙熏40 min，1 d1次，連續28 d。分別于第1天，第14天，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)經腹腔內注射將大鼠麻醉，然后經鼻腔滴入濃度為0.4 mg/ml的LPS液200 μg，并于當天停止煙熏。

3.2 給藥方法：各組大鼠于試驗第1天起開始灌胃給藥，連續28 d。中藥組于試驗第1天開始給予參魚化痰口服液(劑量按4.2 mg/kg體重計算，然后加生理鹽水至10 ml)灌胃，空白組和模型組僅給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續28 d。

3.3 標本采集及處理：給藥28 d后，以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)經腹腔內注射麻醉大鼠，迅速取下右肺，并用10%多聚甲醛液固定后，取材常規石蠟包埋、切片，行ABPAS染色。

4 觀察指標

4.1 支氣管肺組織ABPAS染色病理標本制備：石蠟切片常規脫蠟、水洗，以阿爾辛藍浸染30 min，后以3%醋酸浸染3 min，再水洗，0.5%H2O210 min，蒸溜水沖洗，入Schiff液染色20 min，無水乙醇脫水，中性樹膠封固。光鏡觀察支氣管肺組織病理改變(杯狀細胞呈紅色，黏液呈藍色)。

4.2 杯狀細胞陽染率檢測：每組隨機選取3張切片，每張再隨機選取5個視野，高倍鏡下計數每個視野杯狀細胞陽染數。

4.3 免疫組織化學檢測MUC5AC的表達：采用二步法,嚴格按試劑盒說明書進行操作，采用mage-Pro Plus圖像分析軟件進行光密度(Optical density，OD)值分析。

5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠支氣管肺組織ABPAS染色病理結果 空白組大鼠各級支氣管可見少量杯狀細胞及少量粘液分泌。模型組支氣管可見大量杯狀細胞，且粘液分泌明顯增多，肺泡上皮細胞變性、壞死，甚至脫落，間質可見充血、水腫改變。中藥組總體杯狀細胞數及黏液分泌較模型組明顯減少(圖1)。

圖1 各組大鼠支氣管肺組織ABPAS染色病理結果(ABPAS染色，×200)

2 各組大鼠氣道杯狀細胞計數結果 見表1?？瞻捉M大鼠氣道上皮杯狀細胞數較少，與空白組比較，模型組大鼠氣道上皮杯狀細胞數顯著增多，差異有統計學意義(P<0.01)，中藥組杯狀細胞數也增多，差異有統計學意義(P<0.05)。但與模型組比較，中藥組杯狀細胞數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 各組大鼠MUC5AC蛋白的測定結果 見表2。空白組大鼠MUC5AC輕度表達，模型組明顯升高，與空白組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；中藥組輕度升高，差異有統計學意義(P<0.05)；經中藥干預后，中藥組大鼠MUC5AC的表達減低，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠氣道杯狀細胞計數結果比較(個)

注：與空白組比較，◇P<0.01；與模型組比較，*P<0.05

表2 各組大鼠MUC5AC蛋白表達光密度值比較(OD值)

注：與空白組比較，△P<0.05，◇P<0.01；與模型組比較，*P<0.05

討 論

氣道黏液主要是由支氣管黏膜中的黏液腺和杯狀細胞分泌的，其粘彈性主要取決于黏液中粘蛋白(Mucin，MUC)的含量[9]，而MUC主要是由杯狀細胞分泌。到目前為止，已發現編碼MUC的基因19種，與人類COPD關系最為密切的主要是MUC5AC和MUC5B[10]。引起氣道黏液高分泌的主要刺激物是一些細胞因子和其它一些炎性介質，如IL-1、IL-8、IL-13及組胺、PG、TNF-α等，主要調節MUC5AC和MUC5B的表達，同時促進杯狀細胞增生[11-14]。研究發現，介導杯狀細胞增生以及MUC合成的關鍵信號通路是表皮生長因子受體(EGF-R)酪氨酸激酶信號通路，當氣道受到上述細胞因子和炎性介質刺激后，活化的EGFR將細胞外信號傳到下游信號分子，啟動MUC5AC基因轉錄，導致MUC合成、分泌增加[15-16]，選擇性EGF-R 酪氨酸激酶抑制劑可以抑制杯狀細胞增生[17]，下調MUC5AC mRNA的表達[18]。

氣道黏液高分泌是COPD等慢性氣道疾病的重要病理特征之一，黏液高分泌會導致氣道阻力增加、肺功能下降，細菌容易在氣道內繁殖，引發COPD急性加重，同時也影響纖毛運動，降低纖毛清除能力，形成惡性循環。因此，治療氣道黏液高分泌必然會減少急性發作次數，延緩疾病發展，具有重要的臨床意義。

COPD屬中醫肺脹、喘證、咳嗽等范疇，是由于疾病遷延不愈以致肺、脾、腎三臟虧虛。肺虛宣發肅降失司，痰濁內生；脾虛運化失司，水濕內停成痰；病久及腎，腎虛溫煦失司，三焦氣機不暢，水濕內停，聚而成痰。痰濕日久郁而化熱，肺氣不宣，咳喘而生。病久入絡，氣機阻遏，脈絡瘀阻，遂成血瘀之證，故COPD 的主要病機是痰濕、肺熱、血瘀。

參魚化痰口服液是我院院內制劑，是由清肺化痰逐瘀湯研制而成，處方組成為：魚腥草、桑白皮、黃芩、杏仁、浙貝母、丹參、全瓜蔞、當歸、厚樸、大黃、水蛭、干姜等。方中魚腥草、桑白皮、黃芩、浙貝母、杏仁清肺化痰，平喘止咳；瓜蔞主要清上焦之熱，化痰濁，開胸逐瘀；當歸、丹參活血、化瘀、通絡；水蛭破血、逐瘀、通絡；厚樸化濕、降氣、平喘；大黃通腑、泄濁、清熱、逐瘀；干姜溫中散寒，全方共奏清肺化痰、活血化瘀之功效。

本研究表明，參魚化痰口服液可抑制COPD大鼠支氣管肺組織中杯狀細胞增生，減少MUC的表達，從而減輕氣道黏液高分泌，其機制可能是通過干預EGFR-MUC5AC信號通路來實現。