轉基因高通量檢測技術研究進展

李夏瑩 陳銳 劉鵬程

摘要：轉基因技術在農業領域的應用與發展日新月異，轉基因檢測的需求日趨多樣化、復雜化，現有的轉基因檢測技術體系已經很難滿足轉基因產業快速發展的需要。近年來，以PCR陣列技術、芯片技術、DNA測序技術為代表的轉基因高通量檢測技術發展迅猛。本文就這一領域的研究進展作一簡要概述。

關鍵詞：轉基因;高通量;芯片;DNA測序

中圖分類號： S188 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0027-04

以基因工程為核心的現代生物技術不僅在資源、環境和醫藥等方面日益發揮著重要作用，在農業領域的應用與發展也十分迅猛。2016年是轉基因作物商業化的第21年，轉基因作物的種植面積從1996年的170萬hm2迅速上升到至2016年的1.851億hm2，實現了近110倍的增長。2016年也是轉基因水果和蔬菜的商業化快速發展元年，美國與加拿大先后批準了改善營養指標的轉基因馬鈴薯和耐儲存的轉基因蘋果的市場銷售。2016年，全球26個國家種植了轉基因作物，其中包括19個發展中國家和7個發達國家。發展中國家種植的轉基因作物占總面積的54%，而發達國家占46%。包括中國和印度在內的8個亞太地區國家，在2016年種植了 1 860萬hm2 轉基因作物。2016年轉基因作物的最大種植國仍然是美國、巴西、阿根廷、加拿大和印度。這5個國家加起來的種植面積達到了全球轉基因作物種植面積的91%[1]。截至目前，我國共批準發放7種轉基因作物安全證書，分別是耐儲存番茄、抗蟲棉花、改變花色矮牽牛、抗病辣椒、抗病番木瓜、轉植酸酶玉米和抗蟲水稻，但只有抗蟲棉和抗病毒木瓜實現了大規模商業化生產。二十多年來轉基因商業化進程帶來的巨大經濟、社會效益和顯著的生態效益已充分顯現，它的推廣應用速度之快創造了近代農業科技發展的奇跡。

伴隨轉基因作物種植面積的激增以及轉基因技術研發的日益加速，以及轉基因標志制度與監管需求，現有的轉基因檢測技術體系已經很難滿足轉基因產業快速發展的需要，影響到轉基因產品的安全評價、身份驗證、國內監管、進出口檢驗、企業自控和國際貿易互認，進而影響到國際貿易和國家利益。因此，開發快速、精準、高通量的轉基因檢測方法，建立相應的檢測技術體系是當務之急?，F有的高通量轉基因檢測技術主要包括PCR陣列技術、芯片技術、DNA測序技術。本研究就當前該領域的研究現狀做一簡要概述。

1 PCR陣列技術

聚合酶鏈式擴增技術（polymerase chain reaction，PCR）是目前應用最廣的轉基因方法，包括定性PCR和定量PCR（quantitative PCR，qPCR）。多重PCR（multiplex PCR）可在同一個反應中同時擴增檢測2個或多個目標基因序列，具備高通量檢測的潛質。但由于多重qPCR之間的引物干擾，同時在1個反應管中設計的多重qPCR最多5～6重，很難滿足實際檢測需求。

隨著轉基因農作物種植面積的激增和品種的日益豐富，檢測需求也隨之擴大，現有的檢測方法通量低、過程繁雜，很難滿足轉基因檢測需求。近年來基于qPCR的另一種策略逐步被關注和報道，即利用內含特定引物組合的96孔或384孔預制板用于高通量轉基因篩查。預制板內含有指定濃度的特異引物，形成規律性的矩陣，可同時用于同一模板DNA的多重檢測。該方法也被稱為實時定量PCR陣列/芯片法（real-time PCR array），結合已知的轉基因信息列表，這種轉基因檢測策略能夠有效地簡化試驗操作，增加檢測通量。

PCR陣列技術最早由歐盟聯合研究中心的研究人員于2009年建立。針對歐盟轉基因法規與檢測需求，依據Decision Support System與JRC GMO-Matrix中的信息，將各轉化體、外源基因與元件設計成最簡化的檢測組合，利用歐盟驗證的事件特異性定量PCR方法，可同時在7種作物中檢測39種轉化事件。這種策略能夠有效地增加檢測通量同時降低人為犯錯的風險。后續的研究證明這種策略能夠有效地檢測加工食品與飼料產品的轉基因成分，在轉基因檢測實驗室中被迅速推廣和使用。

Mano等基于96孔預制板設計了可同時檢測15種轉基因玉米、4種轉基因大豆和2種轉基因油菜的qPCR陣列，共計包含21個事件特異性、13個外源插入基因和5個內源基因，檢測低限LOD在0.01%～0.25%之間[2]。

Cottenet等基于384孔板整合了47套qPCR引物和探針，每個孔中進行3重qPCR反應，可同時檢測7個樣本中的47個靶標基因，方法特異性良好，檢測低限LOD低于0.045%[3]。

歐盟聯合實驗室基于96孔板開發了最新版本的轉基因檢測qPCR陣列，包含7個內源基因、5個元件、1個構建特異性和3個事件特異性，涵蓋80多個轉基因品系，可滿足同時檢測歐盟授權的全部轉基因農作物[4]。其中，96孔預制板由Eurogentec SA公司制作，檢測特異性由Life Technologies公司完成。該方法相對老版本有很大改進，進一步滿足了轉基因檢測需求[5-7]。

2 芯片技術

基因芯片（microarray）又稱DNA芯片（DNA microarray），是芯片技術中研究最早、最為成熟、應用最廣泛的產品。基因芯片技術通過固體在基質表面的上千個特定探針，能夠一次性準確地對樣品中不同種類的DNA序列進行定性、定量篩查，具有高通量、集成化和自動化的特點。相對核酸印跡雜交技術，基因芯片技術操作簡單、自動化程度高、檢測效率高，可應用于基因突變檢測、多態性分析、基因表達譜測定、功能基因組研究等領域。

基因芯片技術應用于轉基因檢測的報道很多，相對PCR技術，芯片檢測的成本較高，但在檢測通量方面具備巨大優勢。

Leimanis等開發了Silverquant芯片檢測方法用于轉基因檢測，該方法利用硝酸鹽沉淀來檢測生物素化的擴增產物，在靈敏度和可信度方面要優于熒光染料;該方法覆蓋7個事件特異性、4個轉基因元件和5種內源基因，LOD在0.03%～0.3%之間[8]。Tengs等設計了包含了約4萬個探針的Tilling芯片，涵蓋絕大多數植物轉化用的載體序列，可用于篩查未知轉化事件[9]。Hamels等評價了Eppendorf公司的DualChip轉基因檢測芯片，該產品可一次性進行3個平行試驗，包含12個元件、7個植物內源基因、11個事件特異性和6個control對照。該芯片可檢測到1%的植物成分、0.1%的GMO，準確率大于95%[10]。Kim等針對19個轉化事件開發了DNA芯片，包含27個探針用于檢測內源基因、35S啟動子、事件特異性和內源基因;其中事件特異性檢測包括2個GM大豆、13個GM玉米、3個GM油菜和1個GM棉花，方法檢測低限約為0.5%[11]。Lee開發的轉基因檢測芯片包含4個植物內源基因、2個元件和7個外源基因（P35S、tNOS、pat、bar、epsps1、epsps2、pmi、cry1Ac和cry3B），方法特異性良好，靈敏度均可達到0.5%[12]。Turkec等針對3個GM大豆和9個GM玉米開發檢測芯片，共計設計了1 830個60 nt的探針，最終篩選出33個探針可用于區分12個GMO事件，并開發了1套數據算法來實現最大的檢測通量和靈敏度。作者利用該芯片可直接對土耳其市場流通的食品進行轉基因定量檢測，檢測靈敏度小于1%[13]。

3 高通量測序技術

近年來，以Roche/454、Illumina/Solexa和ABI/SOLiD為代表的高通量測序技術（next-generation sequencing，NGS）極大地推動了以動物、植物和微生物為研究對象的生命科學研究[14-17]。相對于傳統DNA測序方法（Sanger法），NGS因其革命性的技術進步，可在很短的時間內產出千萬倍的測序數據，從而實現對一個物種的基因組或轉錄組的整體覆蓋和全貌精細研究。目前以NGS技術為基礎的全基因組測序、基因組重測序、微生物宏基因組測序、轉錄組測序、小分子RNA測序和表觀基因組測序等手段已廣泛應用于醫學、農業、食品、生態等多個研究領域。NGS技術革新了以基因為研究對象的分子生物學及相關學科研究，策略上實現了由釣魚式到撒網式的點到面的升級，極大地推動了以基因組學與轉錄組學為代表的“組學”技術發展，使從全基因組尺度開展生命科學研究常態化[18-20]。

目前國內外基于NGS技術開展轉基因檢測的研究報道還比較少。Tengs等利用轉錄組測序與差減計算的方法，在轉基因擬南芥中發現了外源插入片段，理論上證明了NGS技術能夠實現轉基因檢測[21]。但由于RNA的時空特異性表達與可變剪接等問題，使RNA的序列復雜度極高，直接導致該研究中基于RNA序列的差減分析存在大量的假陽性結果。Yang等利用NGS技術對轉基因水稻T1c-19和TT51-1進行的分子特征鑒定研究中指出，基于盲檢模型與20倍全基因組測序深度，只能部分識別外源DNA插入片段，并且結果中存在轉基因元件的假陽性判定[22]。

對于大片段轉基因的分子鑒定試驗中，染色體步移策略是無法獲取全長信息的，而NGS技術在轉基因分子鑒定領域具備強大優勢。Zhang等利用NGS技術對轉基因牛中的1個150 kb的人類乳鐵蛋白進行了分子鑒定，一步獲得外源基因全長序列、整合位點和拷貝數等信息，結果通過了事件性PCR和FISH試驗雜交驗證[23]。

Barbau-piednoir等利用NGS技術對1個未授權的GM枯草桿菌進行測序，通過Blast比對發現目的序列，然后設計引物用于事件性qPCR檢測。結果證明，這是有效的針對未授權GMO的檢測策略[24]。Fritsch等利用NGS技術檢測轉基因玉米的純合性，結果證實NGS策略與qPCR相比更具優勢，不需要試驗步驟的優化，統計學上也更加可靠[25]。Sahebi等對NGS技術在植物遺傳育種中的應用進行了綜述指出，NGS能夠解決很多傳統辦法不能解決的問題，但同時大數據的安全存儲和繁雜的數據分析是對研究者的極大挑戰[26]。Willems等對NGS技術應用于轉基因檢測中的數據分析方法進行了討論，作者以轉基因水稻為例進行了測序和分析，提出了用于計算P值的公式和用于陽性結果認定的算法，為NGS技術在GMO檢測中的應用提供了量化標準[27]。

由于主流轉基因農作物的基因組較大（例如大豆、玉米等），全基因組無差別測序需要很高的數據量才能實現有效的全基因組覆蓋深度，這直接導致了昂貴的測序成本、較高的生物信息學計算負荷和大量無法避免的假陽性結果。所以，全基因組無差別重測序策略很難實現有效的轉基因檢測，在測序之前增加特異性富集步驟十分必要。特異性的富集指定區段的DNA序列，而后再進行深度測序能夠對特定的基因組區域或感興趣的位點進行針對性研究，相比于全基因組無差別測序，測序目的性更強，測序成本更低，是高效的NGS研究手段[28]。近年來逐步發展并不斷成熟的相關測序技術包括：外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）[29]、染色質免疫共沉淀技術（chromatin immunoprecipitaion，ChIP）[30]、降解組測序（degradome seuqencing）[31]、DNA甲基化測序（methylated DNA sequencing）[32]和酶切位點相關DNA測序（restriction-site associated DNA sequencing，RAD-seq）[33]等等。

在NGS測序之前先采取目的片段富集的策略，已在微生物和醫學領域存在很多報道[34-36]。在轉基因檢測領域，針對已知元件或外源基因的上下游序列進行特異性富集，是利用NGS技術檢測（未授權）GMO的主要策略。目前按起始基因組DNA的打斷方式可分為3類：直接擴增、隨機打斷和酶切特異性打斷。具體方法包括：（1）長模版快速擴增基因組DNA末端法（long template-rapid amplification of genomic DNA ends，LT-RADE），該方法由RACE技術演化而來，先利用特異性引物單向外擴，PolyC加尾后再用巢式引物擴增，可獲得插入位點的上下文序列[37];（2）線性擴增介導的PCR法（linear amplification-mediated PCR，LAM-PCR），該方法利用生物素標記特異探針，可以利用磁珠富集一鏈cDNA，使用隨機引物獲得二鏈cDNA后，連接接頭再進行巢式PCR擴增可獲得目標片段[38];（3）非限制性線性擴增介導的PCR法（nonrestrictive linear amplification-mediated PCR，nrLAM-PCR），該方法是LAM-PCR的變種，其中二鏈cDNA并不合成，直接使用單鏈DNA接頭連接一鏈cDNA后進行擴增，該方法的缺點是單鏈DNA連接效率較低[35];（4）位點特異PCR法（SiteFinding-PCR），該方法屬于半隨機引物擴增策略，直接利用基因組上的特異序列與基因特異引物配對，可直接擴增獲得目的片段，一般獲得序列長短不一[39];（5）座位特異PCR法（locus-finding PCR，LF PCR），該方法與SiteFinding-PCR方法類似，但在巢式PCR富集步驟中利用已知序列設計接頭用于磁珠富集以提高效率，缺點是該方法只能單向擴增獲得一側序列，一般序列長度小于500 bp[40];（6）高通量的插入追蹤測序法（high-throughput insertion tracking by deep sequencing，HITS），該方法先片段化基因組DNA，經末端修復后連接測序接頭，再結合基因特異引物可擴增插入位點的邊界序列[36];（7）隨機片段PCR擴增法（randomly broken fragment PCR，RBF-PCR），該方法與HITS類似，基因組DNA片段化后加PolyA尾，全部連接測序“Y”形接頭，再經巢式PCR擴增后可獲得目標序列[41];（8）AT接頭法（AT-linker PCR），基因組DNA經酶切片段化后加A尾，再利用特異引物與OligodT復合引物配對可擴增目的片段[42];（9）環狀接頭法（loop-linker PCR），該方法與AT接頭法類似，酶解基因組DNA后直接使用帶黏性末端的環狀接頭與之連接，再經巢式PCR擴增可獲得目的片段[43];（10）TOPO載體連接PCR法（TOPO vector ligation PCR），該方法與A-T linker法類似，但使用一個平末端載體來代替A-T linker，使用載體的上引物與目的基因特異引物配對，可擴增目的片段[44];（11）探針雜交測序法（Southern-by-Sequencing，SbS），利用已知目標序列設計～70 nt探針，用于雜交富集DNA片段再測序，該方法不需要PCR擴增，但必須要預制插入位點附近的序列，不適用于未知轉基因檢測[45-46]。

總的來說，目前NGS技術在GMO檢測上的應用還很有限，DNA富集策略必須依賴預知元件，還沒有非常便捷、低成本的靶標富集方法。GM檢測一般需要0.1%的靈敏度和高通量需求，最好能夠分析混合物種樣本（例如玉米和大豆混樣），要想實現上述技術要求，NGS技術還需要在低成本、高效和寬靶標等方向有所進步。NGS技術為GM檢測打開了新的大門，雖然還存在很多技術瓶頸，但可以預見在不久的未來，隨著測序成本的不斷下降，NGS技術必將成為轉基因檢測領域的主流技術。

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