互葉白千層優株篩選及叢生芽誘導培養

杜尚廣 余波

摘要：本研究以3種互葉白千層枝葉為試驗材料，采用同時蒸餾法提取精油，通過氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用分析鑒定其化學成分。在此基礎上，采用正交試驗對優株誘導培養基的激素種類和濃度進行優化。結果發現，互葉白千層品種2精油中松油醇-4含量為42.9%，1，8-桉樹油素含量為11.24%，較佳的叢生芽誘導培養基為MS+0.05 mg/L NAA+0.15 mg/L 6-BA+0.05%活性炭+0.07 mmol/L硝酸鑭，pH值5.8，該條件下的誘導率是96.4%。結果表明，互葉白千層品種2是高精油優良株系，精油成分符合國際標準（ISO4730—1996），上述叢生芽誘導培養基為最佳誘導培養基。

關鍵詞：互葉白千層;優株篩選;茶樹油;成分分析;叢生芽誘導

中圖分類號： S722.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0044-04

收稿日期：2017-08-24

基金項目：江西省科技支撐計劃（編號：2015ZBBE50020）;江西省南昌市科技支撐計劃（編號：2014HZZC021）;江西省教育廳科技重點項目（編號：GJJ181070）。

作者簡介：杜尚廣（1987—），男，安徽宿州人，博士，助教，主要研究方向為植物資源開發與利用。E-mail：duguangss@foxmail.com。

通信作者：余 波，教授，主要研究方向為植物資源開發與利用。E-mail：yubojxie@163.com。 互葉白千層（Melaleuca alterniifolia）屬于桃金娘科（Myrtaceae）白千層屬（Melateuca）常綠小喬木，原產于澳洲北部沿海地帶，現已被大量引種到部分熱帶和亞熱帶的國家和地區[1]。互葉白千層耐干旱貧乏及漬水地，適合種植在氣溫不低、無霜期長的地區，20世紀80年代引種到我國，現主要分布在廣東、廣西和云南等地[2]。互葉白千層的新鮮枝葉和樹干提取的精油俗稱茶樹油，茶樹油散發出宜人的肉豆蔻香氣，能夠有效、無刺激地殺死人身體皮膚表層的真菌和細菌[3-6]，并對一些病毒具有抑制作用[7-9]，因而廣泛應用于醫用藥品、食品防腐、護膚品、香料產業和農業藥品等領域[10-13]。互葉白千層花色潔白聚生，樹型整齊，氣味芳香，是創建保健園林綠化樹種的首選，且其能夠耐濕生、抗水淹，可以固定河床[14]。所以，種植互葉白千層具有很大的生態和經濟效益。

互葉白千層可分為3種類型，松油醇-4型，桉葉油素型和混合型，現在能被廣為利用的是松油醇-4型[15]。而我國引進的樹種良莠不齊，所提取的茶樹油大部分不符合國際標準，給茶樹油的生產和貿易帶來了許多問題。目前，國內并沒有學者對互葉白千層系統地進行優良精油株系篩選。所以，有必要進行優株的篩選。互葉白千層種子多敗育，發芽率僅10%左右，且后代易產生變異[16]。扦插生根率雖高，但成活率較低[17-18]。而通過快速繁殖技術獲得的組培苗由于具有產量高，易于生產管理，且能保持原有品種的優良性狀等優點，有希望成為互葉白千層產業化育苗的主要繁殖手段。目前，互葉白千層組培快速繁殖技術不成熟，叢生芽誘導率普遍較低。

為篩選獲得互葉白千層高精油產量優株，并解決制約優株叢生芽誘導的瓶頸問題，本課題收集3種不同來源的互葉白千層株系，采用同時蒸餾法和氣相色譜-質譜聯用技術，提取并分析精油成分，對照國際標準，選取得油率高、品質好的優株，再以該株系為試驗材料，采用正交試驗篩選出叢生芽誘導培養基，為培育出大量高品質種苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

互葉白千層：溫室栽培植株，株高20 cm，由江西撫州市森源生物科技有限公司和福建省永安市黃泥家有限責任公司提供。前者提供的材料稱為品種1，后者提供的材料有2個品種，分別稱為品種2和品種3。試驗所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

ZY100型同時蒸餾萃取儀，上海銀澤儀器設備有限公司;ZT-50L型旋轉蒸發儀，鄭州長盛實驗儀器有限公司;QP5050A型氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司;LMQC型立式滅菌鍋，山東新華醫療器械股份有限公司;SW-CJ-2FD凈化工作臺，上海博迅實業有限公司;JY3002電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司;艾柯DZG-303A超純水儀，成都唐氏康寧科技發展有限公司;RDX型智能人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 精油提取和理化常數測定 隨機采取互葉白千層帶葉的嫩枝，用自來水沖洗干凈，隨即陰干，剪碎至50～60 mm并封袋冷藏備用。將100 g剪碎的互葉白千層枝葉放入同時蒸餾儀一端的圓底燒瓶（1 000 mL）中，加入約800 mL蒸餾水，使用電爐加熱;裝置的另一端加入80 mL乙醚作為萃取劑，在水浴鍋上加熱，水浴溫度為34.5 ℃。蒸餾萃取的時間為4 h。蒸餾萃取完成后，用旋轉蒸發儀除去混合液中的乙醚，溫度設定為30 ℃，最后加入60 g無水硫酸鈉，干燥備用。試驗重復 4次，取平均值。相對密度依據GB/T 11540—2008《香料 相對密度的測定》測定;折光指數依據GB/T 14454.4—2008《香料 折光指料的測定》測定;旋光度依據GB/T 14454.5—2008《香料 旋光度的測定》測定;乙醇中溶解（混）度依據GB/T 14455.3—2008《香料 乙醇中溶解（混）度的評估》測定。

1.3.2 氣相色譜-質譜工作參數 （1）色譜柱：柱箱采用程序升溫，起始溫度為60 ℃，保持2 min，之后以8 ℃/min升至 250 ℃，保持5 min。進樣口溫度為250 ℃，以He為載氣，其流速為0.4 mL/min，壓力為56.7 kPa，流出物分流比為 20 ∶ 1。（2）質譜條件：質譜電離方式為EI，接口溫度為 280 ℃，電子能量為70 eV，四級桿溫度為150 ℃，離子源溫度為230 ℃，溶劑延遲3 min。質譜質量掃描范圍為33～400 amu，電子倍增器電壓為1 941.2 V。利用檢索譜庫（NIST14.L）對樣品進行定性分析，并采用峰面積歸一化法對各樣品成分進行定量分析。精油檢測單位是南昌大學分析檢測中心，每個樣品檢測量為1 μL。

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