基于psbA-trnH序列條形碼鑒定21份枸杞屬植物

萬如 王亞軍 安巍

摘要：通過DNA條形碼技術，以psbA-trnH基因為條形碼編碼序列對枸杞屬植物21份試驗材料進行鑒定分析，在分子水平上獲得鑒定枸杞屬植物的理論依據。采用Clustal X比對序列，用Mega 7.0計算遺傳變異距離并比較序列間的差異，基于K2P模型構建系統發育樹。結果表明，psbA-trnH序列的遺傳距離范圍為0.000 0～0.009 2，平均遺傳距離為0.003 0，可以鑒別親緣關系較遠的枸杞屬品種，并且構建的系統發育樹將航天誘變種與普通栽培種分成了2大支，各分支內部均具有較高的自展支持率，因此，psbA-trnH序列可以作為初步鑒定枸杞屬植物的DNA條形碼。

關鍵詞：枸杞屬;DNA條形碼;分子鑒定

中圖分類號： S567.1+90.24 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0056-04

枸杞為茄科（Solanaceae）茄族（Solaneae Reichb.）枸杞亞族（Lyciinae Wettst）枸杞屬（Lycium L.）植物，是多年生落葉灌木[1]，其果實、根皮、葉均具有較高的藥用及保健價值。該屬約有80種，是一個世界分布屬[2]，國內主要種植區域分布在寧夏、新疆、甘肅、青海等地[3]。由于各品種間常有相同的基原或近緣，其發育形態、組織結構及所含的化學成分具有高度的相似性[4]，因此傳統的形態學鑒別方法已難以解決此問題。

DNA條形碼（DNA barcoding）是利用1個或少數幾個DNA片段對目標物種進行識別和鑒定的一項新技術[5]，它具有操作簡便、準確性高、鑒定快速等特點[6]，已成為現代生物分類學研究中引人關注的新方向和研究熱點。近些年來，國內外學者對適合用于鑒定植物的DNA條形碼基因序列進行了積極的探索與研究，發現psbA-trnH基因片段進化速率快，能夠積累較多變異，從而能夠鑒別親緣關系很近的物種[7-10]，因此適宜作為鑒定植物的DNA條形碼。

本研究旨在對21份枸杞屬植物試驗材料進行psbA-trnH的序列測定，并通過序列比對、序列間差異分析及構建系統發育樹，探索其在枸杞屬植物中的適用性，從而為物種鑒定和分類提供依據并奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采樣時間：2017年6月14日。采樣地點：寧夏銀川市（蘆花臺）枸杞國家林木種質資源庫，地處銀川平原西部、賀蘭山東麓，地理位置為105°49′～106°18′E，38°08′～38°52′N，年平均蒸發量為1 583.2 mm，年平均太陽輻射量為 146 kcal/cm2，全年平均日照時數超過 3 000 h，日照率為69%，光能資源豐富，年平均氣溫差為 32 ℃ 左右，無霜期較短，降水量較少，屬于中溫帶干旱型氣候。

采樣品種：在銀川市枸杞國家林木種質資源庫采集21份枸杞屬植物新鮮葉片于5 mL凍存管中，保存于液氮中備用。樣品詳情見表1。

1.2 試驗方法

2017年6月19日至7月21日在寧夏農林科學院枸杞工程技術研究所功能基因分析實驗室進行21份枸杞屬植物材料的基因提取及克隆工作。具體工作流程如下：

總DNA的提?。翰捎眯滦椭参锘蚪MDNA提取試劑盒（DNA secure Plant Kit）提取DNA。

PCR擴增。設計如下引物：P1，5′-GTTATGCATGAACG TAATGCTC-3′;P2，5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′，用以上引物對21個試驗材料在Bio-Rad PCR儀上進行PCR擴增，擴增體系（15 μL）：2×pfumix（pfumix指濃縮PCR擴增預混合溶液）7.5 μL，P1和P2各0.5 μL，模板DNA 2 μL，最后加ddH2O 4.5 μL補足至 15 μL。反應程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，36個循環;72 ℃保溫10 min。將PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

切膠回收：采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對目標條帶進行回收，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行回收檢測，將純化后的目標DNA作為測序反應的模板。

連接轉化：采用pLB零背景快速克隆試劑盒，將回收產物連接于T載體（pGEM-T），再轉入大腸桿菌進行培養。

陽性克隆的篩選及測序：采用藍白斑法篩選陽性克隆，并進行菌落PCR及電泳檢測。最后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 序列統計分析方法

利用Clustal X進行序列比對，用Mega 7.0計算目標序列的堿基組成、序列間的堿基變異頻率和序列間的轉換顛換頻率及其比率。通過比較序列種內和種間差異的分布，利用Mega 7.0構建系統發育樹，評價各序列的鑒定效果。

2 結果與分析

2.1 序列測定結果

測得21份枸杞屬植物葉綠體psbA-trnH間隔序列共21條，在美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站上進行BLAST相似性檢索，均有較好的匹配程度，確認為目標序列，檢索比對結果表明測序結果可靠準確。

2.2 序列信息分析

利用Mega 7.0軟件對目標序列進行分析，結果顯示，21份枸杞屬植物材料的psbA-trnH間隔序列的長度均在546～565 bp之間，其中，北方枸杞和河北枸杞的psbA-trnH序列最長，達到565 bp，其次是黃果變、黑果枸杞、寧農杞5號、昌吉枸杞及6個航天誘變種，長度均為555 bp，寧杞1號至寧杞7號，寧農杞9號及圓果枸杞序列長度最短，為546 bp。21份枸杞屬植物材料的G+C含量也存在差異，變異范圍為30.3%～31.4%。為使試驗結果更加清晰，加入外類群的分析，在NCBI上進行枸杞屬植物psbA-trnH間隔序列的BLAST檢索，找到外類群美國枸杞的序列信息，長度為 513 bp，G+C含量為29.9%（表2）。

2.3 序列比對分析

經過序列比對，發現21條序列之間不僅發生了轉換和顛換，而且存在堿基或片段缺失現象。除了北方枸杞與河北枸杞，其他19種枸杞屬植物均在185 bp處存在19個堿基的缺失，與7個航天誘變種、黑果枸杞、黃果變以及昌吉枸杞相比，其他11種枸杞均在496 bp處存在9個堿基的缺失。利用Mega 7.0軟件計算表明，在21種枸杞屬植物的psbA-trnH序列中，保守位點（C）為566個，變異位點（V）數量為8個，其中簡約位點（Pi）4個，自裔位點（S）4個，其轉換/顛換值（R）為0.2。

2.4 遺傳距離分析

在21份試驗材料psbA-trnH序列比對的基礎上，借助Mega 7.0計算Kimura 2-parameter遺傳距離。結果表明，21種枸杞的遺傳距離為0.000 0～0.009 2 cM，其中遺傳距離最小（0.000 0 cM）的組合有4個，分別是河北枸杞與北方枸杞和圓果枸杞、黃果變與黑果枸杞、寧杞1號至寧杞7號與寧農杞9號、7個航天誘變種，其親緣關系最為接近，而昌吉枸杞與北方枸杞、圓果枸杞、河北枸杞之間的遺傳距離最大（0.009 2 cM），親緣關系最遠，它們的平均遺傳距離為 0.003 0 cM（表3）。

2.5 枸杞屬MP樹鑒定

根據21個枸杞品種的序列測定結果，采用最大簡約數法（maximum parasimony，簡稱MP）構建MP系統發育樹，模型為Kimura 2-parameter，拓撲結構的可靠性用1 000次重復的自展檢測（bootstrap analysis）來評估（圖1）。psbA-trnH條形碼序列的聚類圖分成了2大支，寧杞1號到寧杞7號、寧農杞9號、圓果枸杞、北方枸杞、河北枸杞及外類群美國種聚為1大支，其中寧杞1號至7號與寧農杞9號處于同一分支，親緣關系最近，圓果枸杞、北方枸杞與河北枸杞為同一支，親緣關系最近，外類群美國品種單獨為1支，與上述11個品種的親緣關系最遠。航天誘變種與黃果變、黑果枸杞和昌吉枸杞聚為1大支，與其他品種親緣關系較遠，其中7個航天誘變種聚為同一支，親緣關系最近，黃果變、黑果枸杞、昌吉枸杞聚為同一支，與上述7個品種的親緣關系較遠。

3 結論與討論

由于枸杞屬種質資源較為豐富，起源馴化有多種途徑，栽培歷史悠久，屬內種間雜交現象普遍[11]，且諸多地方品種無科學命名，導致品種資源類型多且名稱亂，因此鑒定評價枸杞屬種質資源具有深刻的意義[12]。本研究中21份種質材料屬于枸杞屬近緣種，在遺傳多樣性鑒定評價過程中，農藝性狀易受環境和栽培技術的影響不易鑒別，細胞學性狀多態性不豐富，此外同工酶性狀有器官特異性且受生長發育階段的影響，具有一定的局限性[13]。而分子標記法的出現，為資源鑒定評價提供了新的方法[14-15]。本研究利用葉綠體間隔序列 psbA-trnH 的保守區設計引物，擴增出完整序列片段，并對擴增產物進行序列測定。經分析得出21份枸杞屬種質資源的psbA-trnH序列長度范圍為546～565 bp，共有8個變異位點，雖然序列過于保守，但其系統發育樹將21份種質材料分成2大類，普通栽培種與圓果枸杞、北方枸杞、河北枸杞聚成1支，航天誘變種與黑果枸杞、黃果變、昌吉枸杞聚為1支，且各分支內部具有較高的自展支持率，表明依據psbA-trnH序列的差異可以鑒定親緣關系較遠的枸杞屬種質，而親緣關系較近的種質資源還需進一步研究。

參考文獻：

[1]袁寶財，達海莉，李曉瑞. 寧夏枸杞的生物學特性及開發利用前景[J]. 河北林果研究，2001，16（2）：151-153.

[2]石志剛，杜慧瑩，門惠芹. 枸杞種質資源描述規范和數據標準[M]. 北京：中國林業出版社，2012.

[3]蘇宇靜，賀海明，孫兆軍. 中國枸杞資源及其在食品工業中的應用現狀和開發前景[J]. 食品科學，2002，23（8）：292-294.

[4]石志剛，萬 如，李彥龍，等. 寧夏枸杞主要品種psbA-trntH的DNA條形碼鑒定的初步研究[J]. 農業科技與裝備，2016（6）：1-2，7.

[5]于 杰，閆化學，魯振華，等. 基于matK和rbcL DNA序列條形碼鑒定橘柑及其近緣屬植物[J]. 園藝學報，2011，38（9）：1733-1740.

[6]Stoeckle M，Waggoner P，Ausubel J. Barcoding life：ten reasons.identifying species by DNA[J]. Consortium for the Barcode of Life，2004：1-2.

[7]陳士林，姚 輝，宋經元，等. 基于DNA barcoding（條形碼）技術的中藥材鑒定[J]. 世界科學技術-中醫藥現代化，2007，9（3）：7-12.

[8]陳士林. 中藥DNA條形碼分子鑒定[M]. 北京：人民衛生出版社，2012.

[9]寧淑萍，顏海飛，郝 剛，等. 植物DNA條形碼研究進展[J]. 生物多樣性，2008，16（5）：417-425.

[10]劉宇婧，劉 越，黃耀江，等. 植物DNA條形碼技術的發展及應用[J]. 植物資源與環境學報，2011，20（1）：74-82，93.

[11]石志剛，馬婷慧，萬 如，等. 基于ITS條形碼序列早期篩選枸杞種內雜交種[J]. 江蘇農業科學，2017，45（6）：138-139.

[12]李小剛，王有科，李 捷，等. 基于nrDNA-ITS序列的10種枸杞屬植物親緣關系研究[J]. 中國農學通報，2014，30（25）：128-135.

[13]石志剛，萬 如，李彥龍，等. 基于ITS條形碼序列的枸杞屬植物鑒定[J]. 湖北農業科學，2016，55（22）：5966-5968.

[14]任 海，呂小紅，杜 萌. 多抗水稻分子標記輔助育種方法[J]. 江蘇農業科學，2017，45（19）：154-158.

[15]李 紅，張 敏，肖千明，等. 基于ISSR-PCR分子標記的滑菇遺傳多樣性分析[J]. 江蘇農業科學，2017，45（6）：39-41.王紅崧，畢振佳，王云月，等. 哈尼梯田傳統稻種遺傳多樣性影響因素[J]. 江蘇農業科學，2019，47（1）：60-66.