果園周邊寄主炭疽病病原菌的系統發育分析

符丹丹 孫建瑞 張紅梅

摘要：從陜西不同地區采集薔薇科、豆科、茄科等植物上具有炭疽病病癥的標樣85份，共分離得到炭疽菌菌株41株，選取21株菌株構建ITS的系統發育樹，結果顯示，21個果園周邊寄主的炭疽病病原菌可初步分為8個類群，選取其中5株代表性菌株進行多基因系統發育樹的構建，結果表明膠孢炭疽菌和果生炭疽菌的菌株除可侵染蘋果外，還可侵染獼猴桃、辣椒、梨等寄主。對其中6個分類單元的10株菌株在蘋果上進行致病性測定，結果顯示所有菌株有傷接種均可發病;而歸屬為尖孢炭疽菌、豬毛菜炭疽菌和西蒙德炭疽菌的菌株無傷接種不能發病，證明它們對蘋果沒有致病性;而分別歸屬于果生炭疽菌、膠孢炭疽菌和松針炭疽菌的菌株無傷接種都可以發病，并表現出典型的蘋果炭疽病癥狀，說明它們對蘋果均為初侵染源，具有致病性，進一步證明果園周邊梨、辣椒、獼猴桃等寄主可以作為蘋果炭疽病潛在的初侵染來源，為炭疽病的有效防治提供了理論基礎。

關鍵詞：蘋果炭疽病;炭疽菌屬;內轉錄間隔區;多基因;致病性測定

中圖分類號：S436.611.1+2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0080-05

蘋果炭疽病是在我國所有蘋果產區普遍發生的一種重要的蘋果病害，它除可危害果實，造成蘋果采摘期大量落果、運輸期及貯藏期果實腐爛，還可侵染枝干、果臺甚至葉片，常年病果率為10%～30%，病害流行年份甚至可造成蘋果減產50%～70%。分析病害流行原因，除天氣因素外，控制菌源就成了防止病害大規模暴發的一個重要因素。蘋果炭疽病病原菌的源頭從何而來？清園不徹底，各種病果、僵果不移出果園，病枝枯枝病蟲多，雜草茂密，甚至用炭疽病病菌的其他寄主植物作為果園屏障，在果園附近種植其他炭疽病病菌寄主植物等都可能是病原菌的侵染源，在氣候適宜時造成蘋果病害大流行。

對于植物病理學家來說，準確鑒定病原是研究植物病害的基礎。蘋果炭疽病病原菌——炭疽菌屬（Colletotrichum）早期的分類主要根據寄主來源劃分，造成了上千個所謂的“麻雀種”，也證明了炭疽菌屬是一種不存在寄主專一性的多寄主植物病原真菌。在膠孢炭疽菌廣義種的概念下，許多植物，如梨、棗子、草莓、葡萄、辣椒、豆角等寄主都可以作為膠孢炭疽菌的寄主，一些其他寄主植物病原菌在人為接種條件下也能在蘋果上致病。Phoulivong等對辣椒、棗子、龍眼、番木瓜、楊浦桃、香蕉等寄主上的膠孢炭疽菌研究發現，它們分別屬于不同的種或類群，因此認為膠孢炭疽菌不再是一個寄主范圍廣泛的病原菌[1]。柿子炭疽病的病原菌也由膠孢炭疽菌變為哈銳炭疽菌[2-3]。對尖孢炭疽菌的研究也得到類似的結果[4-5]。

隨著種級分類標準逐漸明確[6-7]、復合種種級界限劃定，更多植物病原炭疽菌種類須要重新厘定[8-9]。但是在重新劃定蘋果炭疽菌種界限后，其他寄主植物的病原菌在自然條件下與蘋果炭疽病有無關系，能否作為蘋果炭疽病的侵染來源？本研究將通過種群多樣性分析、致病性測定等探索這些炭疽菌在自然條件下作為蘋果炭疽病初侵染來源的可能性，以期為針對性地防治蘋果炭疽病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本采集

2012年從陜西省禮泉縣、眉縣、扶風縣、隴縣、楊凌等地區采集薔薇科、豆科、柿科、獼猴桃科、茄科等植物上具有炭疽病病癥的樣品85份，共分離得到46株炭疽菌，其中25株分離自辣椒（采自陜西省眉縣）、13株分離自柿子（采自陜西省扶風縣、楊凌等地區）、5株分離自梨（采自陜西省隴縣和禮泉縣）、2株分離自獼猴桃（采自陜西省扶風縣）、1株分離自菜豆（采自陜西省禮泉縣）（表1）。所有試驗菌株均保藏于西北農林科技大學真菌研究室。

試劑：DNA標準分子量DSTM 2000，購自廣州東盛生物科技有限公司;十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）、瓊脂糖、buffer、dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶等，均購自西安沃爾森生物技術有限公司。

儀器：BX51顯微鏡、DP72數碼成像系統等，均購自日本奧林巴斯株式會社;PowerPacTM電泳儀、S1000TM PCR擴增儀、Universal HoodⅡ凝膠成像系統等，均購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司;Nanodrop 2000核酸蛋白檢測儀，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;5804R冷凍高速離心機，購自艾本德（中國）有限公司。

1.2 炭疽病病原菌的分離

對于具有炭疽病特征但不產孢的樣品主要采用組織分離法進行分離。先用70%乙醇表面消毒，切取病斑交界處的組織塊放置在PDA平板上，培養4 d后，挑取單個菌落菌絲，轉移到新的PDA平板上，培養7 d將得到的純菌株保存。對于已產生分生孢子團的樣品則采用直接挑取法。在體視鏡下直接用灼燒過的接種針挑取分生孢子盤上分泌的分生孢子，將其接種在新鮮的PDA斜面上，挑取單個菌落菌絲，轉移到新的PDA平板上，培養7 d后將得到的純菌株保存。

1.3 炭疽病病原菌的形態學觀察

根據Sutton的分類系統[10]觀察炭疽病病原菌在PDA和燕麥培養基等2種培養基上的菌落形態。

1.4 DNA提取和系統發育樹的構建

供試菌株在PDA培養基上25 ℃恒溫培養7 d，用接種針挑取菌絲置于離心管中，用改良的CTAB法[11]提取基因組DNA。提取的DNA用核酸蛋白檢測儀測定濃度與純度。擴增反應程序為94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，51 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1.5 min，40個循環;最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（1×TAE電泳緩沖液，130 V電壓），上樣2.5 μL，用熒光染料EZ-VISION One染色，擴增產物在凝膠成像系統下觀察并拍照。

1.5 果園周邊寄主炭疽病病原菌的蘋果致病性測定

為考察果園周邊其他寄主炭疽病病原菌是否會引起蘋果炭疽病的發生，成為果園內蘋果炭疽病暴發的傳染源，選擇部分代表性其他寄主炭疽病病原菌菌株進行蘋果果實的致病性測定，確定為室內蘋果接種，接種挑選健康、表面沒有疤痕傷口的富士、秦冠蘋果，由于有些供試菌株不產孢，為統一試驗條件，接種方法分別選用無傷/有傷菌餅接種。即在該菌株的PDA菌落邊緣用打孔器打下直徑為5 mm的菌餅，同樣在健康果面上用昆蟲針扎直徑約5 mm的傷口，將菌餅貼緊果面傷口處，無傷接種則直接將菌餅黏在果面上，外面纏上保鮮膜固定。所有果實外同樣套上塑封袋，袋內用噴霧器噴霧保濕，在25 ℃恒溫箱內暗培養。每個處理設3次重復。每 5 d 觀察1次，記錄接種結果。對接種發病的果實通過組織分離法轉接PDA平板，觀察菌落形態。

2 結果與分析

2.1 系統發育分析

2.1.1 ITS序列的系統發育分析 選擇本試驗所分離非蘋果寄主炭疽病病原菌中具有代表性的21株菌株，另從GenBank上下載36株最新模式種的炭疽菌序列，以冬青炭疽菌（Colletotrichum falcatum）為外群構建ITS序列的最大簡約（maximum parsimony，簡稱MP）法系統發育樹，共557個特征堿基（包括空位）。最大簡約法分析中有460個保守堿基，25個變異極高不具簡約信息，72個具簡約信息;共保存了100個最大簡約樹。圖1所示的ITS序列系統發育樹是保存的120個最大簡約樹中的第1個（樹長為140，一致性指數為 0.814 3，保留指數為0.977 1，重縮放后的一致性指數為 0.795 6），各分支標示的支持率為最大簡約法得到的自展支持率。

由圖1可知，整個ITS序列的MP法系統發育樹拓撲結構可分為2個大的分類群，在下半部分的尖孢炭疽菌復合群中，Clade 1中采自菜豆上的菌株F12DJLQ1的分類無法確定，因為它只與西蒙德炭疽菌（C. simmondsii）CBS 126524最接近但并沒有聚在一枝，暫定其分類接近于西蒙德炭疽菌;Clade 2中3株采自辣椒上的菌株（F12LJMX22、F12LJMX24、F12LJMX25）與1株尖孢炭疽菌（C. acutatum）BBA71292聚在一起，但沒有支持率的支持，推測其序列與尖孢炭疽菌比較相似，差異不大;Clade 3中4株采自梨上的病原菌菌株和1株采自辣椒上的菌株F12LJMX18都以較高的支持率（81%）與2株松針炭疽菌（C. fiorinae）（模式種CBS 128517*和確定種CBS 235.49）、菟絲子炭疽菌（C. cuscutae CBS 128555和蘋果炭疽菌菌株F10PGBYS08）聚在一枝，由于松針炭疽菌和東方炭疽菌的親緣非常相近，僅憑ITS序列無法將其分開，還須借助其他基因的系統發育分析才能進一步確定其分類，但因這幾個菌株的形態特征與東方炭疽菌中的蘋果炭疽菌菌株差異較大，因此初步推測這幾株菌的分類為松針炭疽菌。而在聚類分析圖上半部分的膠孢復合群中，Clade 4中采自柿子上的菌株F11SYL07以69%的支持率與哈銳炭疽菌（C. horii）的模式種ICPM 10492*聚在一個分枝，推測其分類比較接近于哈銳炭疽菌;Clade 5中2株采自辣椒上的菌株F12LJMX17和F12LJMX21則與1株新西蘭炭疽菌（C. aotearoa）C1301.3聚在一起，但沒有支持率，初步分類暫定其為新西蘭炭疽菌;Clade 6中分別采自獼猴桃和辣椒上的4株菌株（F11MHT02、F12LJMX15、F12LJMX16、F12LJMX20）與3株膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）（模式種CBS112999*和確定種CBS 119204、C1254.3）聚在一起;Clade 7中分別采自獼猴桃、梨和辣椒寄主上的病原菌菌株F11MHT04、F12LZLQ1、F11LJMX10、F12LJMX19與2株果生炭疽菌（C. fructicola）（模式種CBS 130416*和確定種ICMP 17789）聚在一起，但支持率較低;只有Clade 8中菌株F11LJMX09的分類無法單獨依靠ITS序列準確區分，它與豬毛菜炭疽菌（C. salsolae）最為接近但并沒有聚在一枝，而且也沒有支持率的支持，須要參考其他基因的系統發育分析才能準確定位。

最后根據單基因ITS序列系統發育樹的初步分析，暫時初步確定所選取的21株其他寄主炭疽病病原菌的分類大概為尖孢炭疽菌（C. acutatum）、新西蘭炭疽菌（C. aotearoa）、松針炭疽菌（C. fiorinae）、果生炭疽菌（C. fructicola）、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、哈銳炭疽菌（C. horii）、豬毛菜炭疽菌（C. salsolae）以及西蒙德炭疽菌（C. simmondsii）等8個類群，其中只有果生炭疽菌和膠孢炭疽菌是在蘋果炭疽病病原菌中分離得到過的。雖然ITS序列作為應用最為廣泛的條碼基因，在大規模初步分析炭疽病病原菌分類時具有非常大的優勢，但進一步深入研究時，還須結合其他基因綜合分析才能

得到可靠的結果。因此，為確定與蘋果炭疽病病原菌近緣的Clade 3、Clade 6和Clade 7中炭疽菌的準確分類，還須進行多基因系統發育分析。

2.1.2 多基因序列的系統發育分析 選擇本試驗所分離的其他寄主炭疽病病原菌中與蘋果炭疽病病原菌分類相近的5株代表性菌株，另從GenBank上下載42株最新模式種的炭疽菌序列，以冬青炭疽菌（C. falcatum）為外群構建ITS、ACT、GAPDH、CHS-1、TUB2合并基因數據集的MP系統發育樹，合并基因數據集的堿基序列數據集共有2 005個堿基，其中保守位點有1 298個，變異較高非簡約信息位點有162個，簡約信息位點共545個。共保存了100個最大簡約樹，第1個最大簡約樹的參數為樹長1 417，一致性指數為0.712 1，保留指數為0.929 8，重縮放后的一致性指數為 0.662 1，各分支標示的支持率為最大簡約法的自舉支持率。

由圖2可知，本試驗中選取的5株代表性菌株共分成3個分枝，第1個分枝（Clade 1）由1株本試驗中分離自陜西省隴縣梨上的菌株F11LZLX1以95%的支持率與2株松針炭疽菌（C. fiorinae）（模式種CBS 128517*及美國蘋果上的CBS 235.49）聚在一起，證明菌株F11LZLX1應與松針炭疽菌同屬一個分類群單元。第2個分枝（Clade 2）包含1株分離自陜西省眉縣獼猴桃上的炭疽菌菌株F11MHT02、6株蘋果炭疽菌（來自陜西省的5株和河南省的1株）和2株膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）（模式種CBS 112999*和美國的CBS 119204）， 自舉支持率為100%， 證明它們的分類單元應同屬于膠孢炭

疽菌。第3個分支（Clade 3）里3株分別采自梨、辣椒和獼猴桃上的病原菌菌株以100%的支持率自成一個小的分類枝，說明這3株不同寄主的炭疽病病原菌5個不同基因的序列都非常相近，并以88%的支持率與3株蘋果菌株（來自河南省商丘市）和1株果生炭疽菌（C. fructicola）模式種CBS 130416*聚在一起，證明這3株菌很可能屬于果生炭疽菌，但又與蘋果炭疽病病原菌有著明顯的遺傳上的分化。

綜上可知，5株代表性菌株可分為3個類群，分別為松針炭疽菌（C. fiorinae）、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、果生炭疽菌（C. fructicola），其中只有歸屬于膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）的菌株F11MHT02與蘋果炭疽病病原菌完全聚在一起;而歸屬果生炭疽菌（C. fructicola）的3株病原菌菌株（F11MHT04、F11LJMX10、F12LZLQ1）則與蘋果炭疽病病原菌有著細微的區別，不能聚在一個分化枝但同屬一個種;歸屬松針炭疽菌的菌株F11LZLX1則與歸屬菟絲子炭疽菌（C. cuscutae） CBS 128555區別很大，不能歸為一個種。

2.2 非蘋果來源炭疽病病原菌的致病性測定

對果園周邊寄主炭疽病病菌菌株進行致病性測定，由表2可知，與蘋果炭疽病病原菌分類不同的菌株如尖孢炭疽菌（C. acutatum）、豬毛菜炭疽菌（C. salsolae）、西蒙德炭疽菌（C. simmondsii）等種的菌株無傷接種蘋果不能發病，證明這些種對蘋果沒有致病性，不能作為蘋果炭疽病的侵染源。但與蘋果炭疽菌分類相同的種[果生炭疽菌（C. fructicola）、松針炭疽菌（C. fiorinae）和膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）]無傷接種富士蘋果都可以侵染，并呈現典型蘋果炭疽病癥狀，即先產生淺褐色圓形病斑，后逐漸加深，果面稍凹陷，接種處可見白色菌絲（圖3）。說明果生炭疽菌和膠孢炭疽菌的菌株除對蘋果具有致病性，可以作為蘋果炭疽病潛在的侵染源，要特別注意在果園內及周邊地區清除這些寄主，以避免蘋果炭疽病的發生。

3 討論與結論

我國是一個幅員遼闊物種豐富的國家，尤其在高溫高濕的多雨季節，植物炭疽病的發生就具有非常廣泛的普遍性，甚至有時在局部地區大規模的流行，如2008年安徽碭山暴發的梨炭疽病、貴州鳳崗的辣椒炭疽病和2011—2013年在整個黃河故道蘋果產區暴發的蘋果炭疽葉枯病等，都給當地農民帶來了巨大的經濟損失[12-17]。作為蘋果生產大國，我國蘋果的產量和銷量已經連續多年居世界第一。為更好地防治蘋果生產中的重要病害，清除果園及周邊地區侵染菌源就成為防治病害大規模暴發的一個有力手段，而據報道炭疽菌除可侵染蘋果外，還可侵染同為薔薇科的梨和海棠等植物，除此以外，劉建標曾報道常作為蘋果園防護林的刺槐也能被炭疽菌侵染，病菌可在刺槐種莢上長期存活，靠風雨傳播可造成與蘋果之間的交叉感染[18]。

為考察果園周邊寄主植物炭疽病病菌是否能成為蘋果炭疽病的潛在初侵染源，本研究從陜西各地采集薔薇科、豆科、茄科等植物上具有炭疽病病癥的樣品85份，共分離得到41株炭疽菌菌株，選取具有代表性的21株菌株，以冬青炭疽菌為外群構建ITS序列的MP系統發育樹，結果顯示21個周邊寄主炭疽病病原菌菌株可分為8個類群，分別為尖孢炭疽菌、新西蘭炭疽菌、松針炭疽菌、果生炭疽菌、膠孢炭疽菌、哈銳炭疽菌、豬毛菜炭疽菌、西蒙德炭疽菌等。選取其中可能與蘋果炭疽菌分類相同的5株代表性菌株進行多基因（ITS、ACT、GAPDH、CHS-1和TUB2）系統發育樹的構建，結果顯示5個菌株可分為3個分類單元，分別為松針炭疽菌、膠孢炭疽菌、果生炭疽菌，這表明從梨、辣椒和獼猴桃上分離得到的歸屬于膠孢炭疽菌和果生炭疽菌的炭疽菌菌株與蘋果炭疽菌菌株分類相同，暗示了果園周邊梨、辣椒和獼猴桃等寄主的炭疽病病原菌可以作為蘋果炭疽病潛在的初侵染源。

按分類和寄主的不同選取10株代表性供試菌株進行蘋果上的致病性測試，結果顯示與蘋果炭疽病病原菌分類不同的種，如尖孢炭疽菌、豬毛菜炭疽菌、西蒙德炭疽菌等種的菌株無傷接種蘋果時不發病，說明這些種對蘋果沒有致病性。與蘋果炭疽病病原菌分類相近的種，如果生炭疽菌、膠孢炭疽菌和松針炭疽菌無傷接種蘋果時都可以發病，并呈現典型的蘋果炭疽病癥狀，證明這些種的菌株對蘋果具有致病性，因而它們的寄主獼猴桃、辣椒和梨可作為蘋果炭疽病的侵染源。

通過ITS及多基因系統發育分析和致病性檢測幾種方法相互驗證，證實茄科的辣椒、獼猴桃科的獼猴桃以及薔薇科的梨等植物炭疽病病原菌菌株和蘋果炭疽病病原菌菌株分類相同，因此它們也可作為蘋果果園炭疽病病原菌的初侵染源，在建新園時要盡量避讓，不要在種植有這些植物的周邊建園，對多年的老果園在平時的日常防護中也要特別加以注意，比如有些果農為了增加自己的經濟收入，在果園內經常種植類似辣椒之類的蔬菜，而不知道這些蔬菜也有增加蘋果炭疽病發病的可能。如果果園內或周邊有其他寄主，在防治蘋果炭疽病的同時也應對這些寄主進行預防，不能等到發病時才去治療，那時就可能已經造成嚴重的經濟損失。

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