麻風樹芽枯病的發生特點及病原鑒定

吳躍開 歐國騰

摘要：麻風樹芽枯病是貴州省境內麻風樹人工林中最常見、最重要的病害種類之一，其癥狀主要表現為葉芽不能萌發，或剛萌發即枯死，導致病株出現大量“光稈”枝條，且在病害發展后期整個枝條枯死。通過一系列研究，包括病菌的分離培養、致病性接種、形態特征觀測以及rDNA-ITS序列分析，證實引起該病的病原菌為小新殼梭孢[Neofusicoccum parvum （Pennycook & Samuels） Crous，Slippers & A.J.L Phillips]。由該病原菌引起的麻風樹芽枯病在國內外均系首次報道。

關鍵詞：麻風樹;芽枯病;病原;小新殼梭孢

中圖分類號： S763.15 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0085-03

作為新興的能源樹種，麻風樹（Jatropha curcas L.）在近年來得到廣泛重視，目前在國內外氣候適宜的地區均有大面積的種植[1];與此同時，人工林的大面積建設導致麻風樹病蟲害問題十分突出。根據連續幾年的野外調查結果，筆者發現許多麻風樹植株在每年的生長季節中，存在許多“光稈”枝條，系枝條上葉芽受到病菌感染而失去活力、不能正常萌發生長所致，因而稱之為芽枯病。該病的發生會導致大量枝條不能萌發且在病害發展后期整個枝條枯死，直接導致麻風樹能源林分的生產力及其果實產量受損嚴重，從而成為麻風樹上最重要病害種類之一。然而，迄今為止，這一特殊的病害類型及其致病病原在國內、國外均未見相關報道，更無從談及對于該病的有效防治。鑒于此，本研究對該病的發病特點及其致病病原物進行初步研究，以期為將來的病害流行學研究及其科學防控技術研究提供必要的基礎科學依據。

1 材料與方法

1.1 病害調查

病害調查時間為2014年5月中旬，所調查麻風樹林分位于貴州省羅甸縣茂井鎮高里村，為丘陵山地的中上坡位，主要坡向為南或西南，海拔范圍為480～550 m。調查代表面積 10 hm2，所栽麻風樹為7～8年生中幼林。病害調查內容主要包括發病時間、發病癥狀、受害株率、危害程度、危害后果等。

1.2 病害采樣及分離培養

采集具有典型芽枯癥狀的病枝，帶回實驗室進行研究。對采集到的病害標本盡快實施病菌分離操作，分離部位包括枯芽部位的病健交界組織、病部中間組織以及芽眼病斑上的病菌子實體。分離前先將病枝截成小段，用自來水沖洗干凈，然后用無水乙醇擦洗消毒（重點處理芽眼病部），用乙醇燈火焰蘸燒，然后用消毒的刀片切開，用接種針挑取相應的病部組織迅速轉置于試管中的培養基上，在28 ℃恒溫條件下進行培養。分離培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基。分離培養出的培養物各通過2次轉管進行純化，最終將所獲培養物（菌株）按采集地點、采集時間及標本號進行統一編號，于 4 ℃ 冰箱內保藏備用。

1.3 致病性接種試驗

試驗時間為2015年4月上旬。向純化的試管菌種中加入無菌水并攪勻以制成菌體懸浮液或直接用病菌子實體制作孢子懸浮液。供試麻風樹苗選用健康無病的2年生容器實生苗，接種時用毛筆蘸菌液涂抹整個莖部，共處理10株;另選10株直接涂抹無菌水作為對照。用塑料薄膜包裹接種部位以保濕（同時避免其他病菌感染）。將各試驗苗置于人工小溫棚內，棚內溫度為20～30 ℃。涂菌處理與對照處理的苗木要間隔一段距離以避免交叉感染。1周后開始觀察發病情況。最后，從病菌接種后形成的病斑上再次分離培養，通過形態特征的觀測確定分離到的菌株與接種菌株是否為同一種。

1.4 病原菌形態特征觀測

對已經產生子實體的標本，可直接進行徒手切片，在顯微鏡下觀測記錄子實體結構、大小，以及其中孢子的形態特征。對人工分離物進行鏡檢時，鏡檢內容包括菌落形態、生長速度、顏色，分生孢子形態、大小、顏色，以及產孢結構形態等特征。

1.5 分子生物學研究

將獲得的純培養菌落委托北京三博遠志生物技術有限責任公司進行核糖體RNA（rRNA）基因內轉錄間隔區（ITS）的序列測定。依據ITS序列，采用MEGA 4.0中的鄰接法（neighbor-joining method，簡稱N-J法）進行系統樹的構建，并用Bootstrap對進化樹進行1 000次可信度分析。

1.6 病原的分類鑒定

根據病原菌的形態特征，結合分子生物學研究結果，參考相關文獻資料，對病原物進行分類鑒定。

2 結果與分析

2.1 病害危害情況

芽枯病在所調查的麻風樹林分中普遍發生，感病株率達73%（n=100）。在受害植株中，感病枝條數為1～3根的占24%，4～6根的占35%，6根以上的占41%。病害的發生導致許多麻風樹植株的大量枝條不能萌發而呈光稈狀，最終干枯死亡，癥狀十分顯眼;該病的發生對麻風樹的正常生長及林分產量造成嚴重影響。從發病率、危害后果方面看，該病害可被列為貴州麻風樹的頭號危險性有害生物。

2.2 病癥特點

每年春末夏初，當麻風樹樹液開始流動時，病菌即開始其侵染進程;病菌主要從芽眼部位入侵，導致芽位組織變色腐爛，流出紅褐色汁液，嫩芽變褐枯死;隨后，圍繞芽眼形成灰白色病斑并逐漸擴大，病斑上可見生長許多黑色顆粒狀物（為病菌的子實體）。在一般情況下，受害枝條上的大多數芽會同時受到侵染危害，感病的芽均不能正常萌發，或剛萌發即枯死，結果導致整個枝條呈光稈狀，最終整個枝條枯死（圖1-a～ 圖1-d）。5—7月是該病的發病盛期。

需要說明的是，該病菌除了主要侵染芽眼外，也可以侵染枝干上的其他部位，形成典型的潰瘍下陷斑，在這種情況下，該病易與由七葉樹殼梭孢（Fusicoccum aesculi）引起的枝干潰瘍病[2]混淆。事實上，這2種病害在麻風樹林分中常?；旌习l生危害。

2.3 病原形態特征

在人工PDA培養基上，由各部位分離培養形成的菌落特征相似。菌落初為白色、緊密，后變為灰色，直至呈暗灰色，一般不易形成明顯的子實體（圖1-e）。

基于病斑上自然形成的子實體的解剖觀測結果如下：分生孢子殼單生或幾個呈單層聚生于子座內，后期突破寄主表皮;

分生孢子殼呈球形，直徑為150～200 μm（n=20），有或無乳突，殼壁由暗褐色厚壁細胞組成，使其呈暗褐色或黑色;分生孢子梗成層著生于整個內部殼壁上;分生孢子呈淡橄欖色，長橢圓、擬鞋底形，無隔，一端鈍園，另一端稍顯平截，大小為（4.7～7.9） μm×（12.86～22.04） μm（n=20）。子囊殼的大小、形狀與結構與分子孢子殼相似，不易區分。子囊具雙囊壁，棍棒形，大小為（18～24） μm×（82～155） μm，內含8個子囊孢子，子囊孢子呈卵圓形、寬橢圓形，大小為（8.35～12.16） μm×（17.45～20.56） μm（n=20），詳見圖1-f～圖1-m。

2.4 致病性接種試驗

由于人工培養菌落不易產孢，病菌懸浮液直接由病斑上的子實體研磨加無菌水配制而成，其孢子濃度為1.6×105個/mL。接種后1周，大多數芽眼部位出現流汁現象，2周后，流汁現象更嚴重，有些剛剛冒出的新嫩芽出現變色枯萎;1個月后，在芽眼部位呈現明顯的病斑，直徑為2～5 cm。3個月后，病斑呈現灰白色，上面著生黑色顆粒狀物，與野外癥狀相似。對照處理的苗木均正常生長發芽、展葉甚至抽枝。由病斑部位的顆粒狀物分離培養的菌落和接種菌的菌落形態特征一致，顆粒狀物解剖特征也與接種病原菌一致，從而驗證了科赫法則。

2.5 分子檢測鑒定

通過多次分離純化，獲得代表性病原菌株MY01。以MY01菌株DNA為模板，利用常用引物ITS1（5′-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3′）及ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′）為探針擴增ITS序列。圖2是該病菌的ITS序列。

將該DNA序列在NCBI（美國國立生物技術信息中心）網站的GenBank上利用BLASTN模塊進行BLAST，對MY01的ITS序列進行同源性分析。根據BLAST結果，該菌株與JN222970[小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）]的同源性達100%，詳見圖3。

3 結論與討論

根據以上研究結果，證實引起麻風樹芽枯病的病原菌為小新殼梭孢[Neofusicoccum parvum （Pennycook & Samuels） Crous，Slippers & A.J.L Phillips]，在現代分類系統中屬于子囊菌門（Ascomycota）座囊菌綱（Dothideomycetes）葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales）葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）新殼梭孢屬（Neofusicoccum），其有性型為葡萄座腔菌（Botryosphaeria parva Pennycook & Samuels）。有研究表明，該菌為世界廣布種，且寄主范圍十分廣泛，是許多植物的重要病原菌[3]。其中，國內報道該菌可侵染危害藍莓、核桃、毛葡萄、桉樹、柏木、油桐等[4-9]。然而，迄今為止，國內外均未有關于該菌侵染危害麻風樹并引起嚴重芽枯病的報道。

小新殼梭孢在系統發育上與同屬的N. ribis比較相近，它們在形態上十分相似，容易混淆，相互之間的區別必須依據rDNA-ITS和EF-1a基因序列分析[3]。同時值得一提的是，N. parvum自身的種內遺傳多樣性很高，使得系統發育分析結果為同一種的不同菌株間在菌落特征、形態特征等方面卻存在一定變異[10]。這也可能是不同研究對N. parvum的形態描述存在差異的原因。

研究表明，小新殼梭孢對麻風樹的致病性極強，一旦發現植株感病，往往為時已晚。因此，對該病的防治應該以預防為主，即加強林分的水肥管理，提高樹木生長勢，必要時輔以預防性噴藥處理;發病初期及早噴藥處理也可以獲得一定的療效;發病晚期則應該將感病枝、感病梢修剪掉，連同病死株集中銷毀，最大可能地剔除傳染源。對病株周邊的健康植株，在秋季落葉或春季萌發前噴施化學保護劑可以起到一定的預防作用。當然，下一步要加大對病原菌的生物及生態學特性的深入研究，切實掌握麻風樹芽枯病的病害流行學特點，通過多方面的試驗掌握科學可靠的綜合防控措施。

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