平邑甜茶根尖染色體制片技術優化及核型分析

2019-08-13 08:55:35王彥華麗源錢關澤

江蘇農業科學 2019年1期

王彥華麗源錢關澤

摘要：為探討制備平邑甜茶染色體制片的最佳技術參數，以平邑甜茶根尖為試驗材料，比較材料的不同采集時間、預處理方法、酶解時間和后低滲時間對平邑甜茶根尖染色體制片的影響。結果表明：在26 ℃培養條件下，平邑甜茶最佳取材時間為11：00—11：30;4 ℃低溫冰水混合物進行預處理能夠獲得較為分散的染色體標本;酶解采用2.5%果膠纖維素混合酶在37 ℃下處理最佳時間為2 h，后低滲最佳時間為20 min。核型分析發現平邑甜茶染色體屬于小型染色體，染色體臂比變化在1.01～2.46之間，差異不大，核型組成成分為中部著絲點染色體（m）、亞中部著絲點染色體（sm），核型屬于2B型。

關鍵詞：平邑甜茶;根尖;染色體制片;核型分析;去壁低滲法

中圖分類號： Q949.751.8;S685.120.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0091-06

平邑甜茶[Malus hupehensis （Pamp.） Rehd. var. mengshanensis G. Z.Qian]是薔薇科蘋果屬植物，屬于湖北海棠的一個變種，典型的無融合生殖型三倍體植物。20世紀70年代開始，就有人試圖將人類染色體標本制備方法引用到植物材料上來[1-3]，如今植物方面的染色體制片已經取得了很大的進步，但是目前在平邑甜茶植物染色體制片方面的報道很少，林盛華等報道平邑甜茶為三倍體植物，染色體數為 2n=3X=51[4]，梁國魯報道了用胰酶法誘導山荊子染色體中期G帶的研究[5]，周攀等報道了利用風油精制備平邑甜茶染色體制片技術的研究[6]。平邑甜茶在細胞學方面的研究很少，主要原因在于染色體小，數量較多，制片時染色體難分散，制片難度大。染色體制片一般分為壓片法和去壁低滲法。壓片技術能快速制備染色體臨時片[7-8]，但壓片法容易殘留過多的細胞質，且染色后著色程度受染色劑影響很大，染色體和細胞質不易區分，很難獲得效果好的壓片[9-10]。去壁低滲法可以很好地使染色體分散開，但操作中會受到諸多因素影響，技術不熟練的情況會對結果造成影響。本試驗取平邑甜茶種子根尖運用去壁低滲法進行染色體制片，從不同取材時間、預處理劑、酶解濃度、酶解時間、后低滲時間等方面進行對比，對制片技術進行討論，為平邑甜茶細胞學研究提供清晰度高的染色體制片，并且對其進行核型分析，旨在為平邑甜茶基因組原位雜交提供細胞學基礎及技術支撐，奠定山荊子組植物細胞分子遺傳圖譜的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為平邑甜茶種子根尖，于2016年9月在山東省臨沂市平邑縣采集平邑甜茶果實，收集種子，晾干后用水浸泡24 h，鋪在有1層濾紙2層紗布的培養皿中，在5 ℃下培養 15 d 打破休眠，放于26 ℃培養箱中，待根尖長至0.5 cm時截取并進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 取材時間于24 h內取平邑甜茶根尖，每隔30 min取材1次，進行預處理制片。

1.2.2 預處理分別將所取的根尖材料用0.2%秋水仙素、2 mmol/L 8-羥基喹啉、飽和α溴萘預處理液處理2～4 h，然后在4 ℃冰水混合物低溫冰浴分別處理21、22、23、24 h。

1.2.3 固定預處理后的材料置于-20 ℃的卡諾式固定液[乙醇 ∶ 冰醋酸=3 ∶ 1（V/V）]中固定2～24 h。

1.2.4 前低滲將平邑甜茶根尖從固定液里取出，用蒸餾水沖洗3次，浸泡10 min后加入到0.075 mol/L KCl溶液中處理30 min進行前低滲，使根尖細胞充分吸水，細胞器細胞質破散，細胞壁易于酶解，染色體分散。

1.2.5 酶解固定24 h以上之后用水沖洗3次，再用濃度為2.5%的果膠酶纖維素酶混合液在37 ℃下分別處理1、2、3 h。

1.2.6 后低滲將酶解后的根尖細胞在常溫下蒸餾水浸泡，讓平邑甜茶根尖細胞吸水更加膨脹，使細胞壁破裂，細胞質破散，染色體更容易分散，細胞膜失去約束容易破裂，所以低滲時間應控制在一定范圍，本試驗后低滲進行3個時間處理——10、20、30 min。

1.2.7 鏡檢之后在NIKON ECLIPSE 80i共聚焦熒光顯微鏡及圖像分析系統下鏡檢并拍照。

1.2.8 染色體核型分析選出染色體分散良好的5個中期細胞測量每條染色體長度（長、短臂長度，隨體不計算在內），計算公式如下：

染色體相對長度=（單一染色體總長度/全組染色體總長度）×100%;

染色體相對長度指數=單一染色體長度/全組染色體平均長度;

臂比值=長臂長度（L）/短臂長度（S）;

核型不對稱系數=全組染色體長臂總長度/全組染色體總長度×100%;

著絲點指數=短臂長度/單一染色體總長度×100%;

核型分析采用李懋學與陳瑞陽標準[11]，依據Lever等兩點四區命名系統[12]，核型分類標準參照Stebbins的標準[13]，參照Arano公式[14]計算核不對稱系數。

2 結果與分析

2.1 取材時間

不同時間取材制作的染色體制片觀察結果見表1，可知平邑甜茶種子根尖最佳取材時間是一天之中的11：00—11：30，此時間段的平邑甜茶種子根尖生長旺盛，中期分裂相對較多，形態清晰，便于取材制片。

2.2 預處理劑與預處理時間的選擇

對不同預處理劑及處理時間進行比較，結果見表2和圖1。其中使用0.2%秋水仙素和飽和α溴萘溶液處理2 h時根尖染色體都是凝縮程度不足，拖尾現象嚴重（圖1-A、圖1-G）;用0.2%秋水仙素處理3 h和4 h粘連聚集現象又很嚴重（圖1-B、圖1-C）;飽和α溴萘溶液處理3 h的染色體分散一般，但凝縮過度（圖1-H），而處理4 h又出現了粘連，染色體依然凝縮過度（圖1-I）。2 mmol/L 8-羥基喹啉溶液處理一直有粘連現象（圖1-D、圖1-E、圖1-F），也就是說用預處理劑處理平邑甜茶根尖染色體都會出現粘連和聚集的現象。用4 ℃冰水混合物處理22 h以內染色體比較分散，沒有粘連現象（圖1-J、圖1-K），而4 ℃冰水混合物處理23 h和24 h，染色體就凝縮過度，并有聚集現象（圖1-L、圖1-M），處理22 h染色體長度適宜，分散良好，清晰度好，是最佳的預處理方法（圖1-K），因此本試驗以4 ℃低溫處理22 h的方式進行預處理制片。

2.3 解離時間的選擇

利用2.5%果膠酶纖維素酶混合酶液在37 ℃下進行不同時間的酶解處理比較，結果見圖1。其中酶解處理0.5 h時有大量細胞壁存在，大量的細胞堆積，不分散（圖1-N）;酶解處理1 h時細胞壁酶解效果一般，大量細胞質殘存，染色體稍微粘連，不夠分散（圖1-O）;酶解處理2 h時，酶解程度適宜，細胞壁被酶解掉，細胞質分散了，染色體分散良好，計數方便（圖1-P）;酶解3 h時，細胞出現破裂，染色體發生了缺失，酶解過度（圖1-Q）。因此平邑甜茶根尖最佳酶解時間為2 h，酶解溫度為37 ℃。

2.4 后低滲時間的選擇

不同后低滲時間處理比較結果見圖1，其中后低滲 10 min 時，平邑甜茶染色體并沒有分散開，有粘連現象，計數困難（圖1-R）;后低滲20 min時染色體分散良好，計數方便，背景干凈（圖1-S）;后低滲30 min時染色體過于分散，有丟失現象，后低滲過度（圖1-T）。因此平邑甜茶根尖最佳后低滲時間為20 min。

2.5 平邑甜茶根尖細胞染色體核型分析

選擇50個染色體分散良好的細胞觀察計數，發現47個細胞染色體數目為51條，3個細胞染色體數目為63條，分別占總計數的94%和6%，因此確定平邑甜茶體細胞染色體數目為2n=51。根據平邑甜茶中期染色體對平邑甜茶進行核型分析，詳見圖2、圖3和表3。

按Kuo的分類標準[15]，可將平邑甜茶體細胞劃分為4個組：L組（第1、第2、第3、第4對）、M2組（第5、第6、第7、第8、第9對）、M1組（第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16對）、S組（第17對），染色體相對長度組成為2n=51=L+5M2+7M1+1S。

按照Levan等的分類標準[12]，平邑甜茶核型公式為2n=3x=39m+12sm（SAT）。13對中部著絲粒染色體，4對近中部著絲粒染色體，在第3對染色體短臂上帶有隨體，染色體相對長度變化是1.3%～2.8%，著絲點指數變化是28.86%～49.76%，平均臂比值1.50。

根據Arano的分類方法[14]，核型不對稱系數是64.03%。

根據Stebbins的分類標準[13]，染色體最長與最短染色體比值是2.13，臂比值大于2的染色體占全部染色體比例為0.12，屬于2B型。

3 討論

植物染色體制片技術是植物遺傳學、染色體工程、植物細胞生物學、植物細胞分類學和物種生物學等眾多學科的基本試驗技術[16-18]。植物細胞染色體的觀察和分析，對于染色體核型分析以及培養過程中細胞變異等遺傳學現象的研究具有重要意義[19]。杜培等對花生根尖染色體制片，認為45%醋酸處理根尖效果比酶解去壁HCl解離經濟實用，效果相差微小，該方法適用于花生、芝麻、水稻、玉米等植物[20];顧蔚等對華中五味子染色體制片，發現用0.1%秋水仙素處理1 h，1 mol/L 鹽酸解離12 min制片分散效果最佳[21];虢國成等認為去壁低滲法制備大麥和玉米染色體制片比壓片效果好[19];李曉玲等用對二氯苯處理3～4 h，1 mol/L HCl 60 ℃解離 13 min，改良石碳酸品紅染色10 min制作樹型金銀花染色體制片最佳[22];洪培培等用0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理一串紅根尖并用壓片法制片效果最好[23];王超等用α-溴萘與對二氯苯混合液，0.002 mol/L 8-羥基喹啉和0.1%秋水仙素，對木薯根尖預處理2 h、酶解時間4 h，染色體制片效果最好[24]。這些研究表明不同物種制作染色體制片最佳處理條件不同，而對于平邑甜茶染色體制片報道很少，良好的染色體制片會受到很多因素的影響，取材就是個重要因素[21]。通過對平邑甜茶的根尖進行不同時間的取材，發現一天之中 09：00 前，其根尖細胞基本不分裂，從09：30開始平邑甜茶根尖細胞開始進入分裂期，但至11：00時處于分裂中期的細胞所占比例開始增加，持續到11：30后大部分細胞進入分裂后期直到12：00分裂基本結束。

染色體制片過程中預處理很重要，不少研究表明，預處理是染色體制備的關鍵步驟之一[16]。預處理持續時間的長短取決于染色體大小、材料大小、溫度和植物的耐藥性等諸多因素[25]。通過對平邑甜茶根尖進行4種不同預處理劑的不同時間處理，發現藥物性預處理都會普遍導致染色體出現聚集和粘連的現象，處理時間不夠，拖尾現象嚴重，處理時間過長染色體凝縮過度，這也印證了前人所述，預處理過度，染色體縮得很短，縊痕不清晰，壓片時部分甚至全部染色體粘連或者聚縮成團，尤其是長時間處理易引起上述現象的發生[26]。而4 ℃低溫處理能使染色體凝縮程度適宜，分散良好，冰水混合物處理是比較合適的預處理方式。

酶解的作用是軟化細胞壁，并且將細胞間的果膠層除掉，方便制片。根據不同酶解時間的比較試驗，確定時間過長染色體容易缺失，過短則酶解不徹底，細胞粘連，染色體不能得到釋放，果膠纖維素混合酶液酶解2 h染色體分散良好，細胞質殘留少。

后低滲是否適宜，常常是試驗成敗的關鍵之一，材料在蒸餾水中停留時間過長，會引起原生質體解體[27]。通過對平邑甜茶根尖后低滲時間的不同處理，發現后低滲短于10 min原生質并未破裂，染色體聚集現象嚴重，不分散;后低滲長于 30 min 原生質解體，染色體分散過度，容易丟失，時間過長。通過比較，后低滲20 min原生質剛剛解體，染色體分散良好，易于觀察。

核型分析是探討植物親緣關系和進化趨勢的一個重要途徑，核型的類型是衡量物種進化程度的重要依據，在長期進化中，染色體數目、結構都在改變，核型也隨之改變，早在20世紀80年代，在蘋果屬核型研究方面就有很多研究報道，蒲富慎對蘋果屬11個種進行染色體核型分析，發現山荊子、毛山荊子、新疆野蘋果較為原始[28]。有研究表明我國蘋果屬中22個不同類型染色體數目和核型進而研究進化趨勢[29-30]，林盛華對蘋果中3個雜交種染色體數目研究發現了10個單株是四倍體[4];肖艷等通過對蘋果屬植物6個類型核型分析，證明了蘋果屬植物多倍體和染色體倍性變異[31];本研究中，觀察到平邑甜茶染色體屬于小型染色體，染色體臂比變化為 1.01～2.46，差異不大，核型組成成分為中部著絲點染色體（m）、亞中部著絲點染色體（sm）核型屬于2B型，這與梁國魯等報道[30]一致。在染色體相對長度比，平均臂比、著絲點指數、相對長度、不對稱系數方面有所差異，導致這種核型差異可能原因是無融合生殖中染色體結構產生了變化，但核型變化是否影響到繁殖能力，需要進一步研究。

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