養(yǎng)殖大鯢腸道細(xì)菌多樣性

蘭阿峰 郭素芬 彭浩

摘要：純培養(yǎng)分離大鯢腸道細(xì)菌，選用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增，測(cè)序后提交序列并分析;免培養(yǎng)方法采用試劑盒提取腸道內(nèi)容物總DNA，選用細(xì)菌通用引物對(duì)總DNA進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增，構(gòu)建克隆文庫(kù)，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR-RFLP分析，用Hae Ⅲ內(nèi)切酶進(jìn)行片段插入性驗(yàn)證并進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。純培養(yǎng)獲得103個(gè)菌株，分屬于16個(gè)不同的可操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTUs），系統(tǒng)發(fā)育分析表明這些克隆序列分別屬于變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）。其中，變形菌門(mén)（占克隆總數(shù) 87.63%）為最優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。免培養(yǎng)結(jié)果將隨機(jī)挑取的105個(gè)陽(yáng)性克隆歸為15個(gè)OTUs，系統(tǒng)發(fā)育分析表明這些克隆序列分別屬于變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）4個(gè)門(mén)。其中，變形菌門(mén)（占克隆總數(shù)的71.43%）為最優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。養(yǎng)殖大鯢腸道細(xì)菌多樣性豐富，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究的價(jià)值。

關(guān)鍵詞：養(yǎng)殖大鯢;腸道細(xì)菌;純培養(yǎng);免培養(yǎng);多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)： S966.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）01-0146-06

中國(guó)大鯢（Andrias davidianus）別稱“娃娃魚(yú)”，屬于兩棲綱有尾目隱腮鯢科，是現(xiàn)存?zhèn)€體最大的兩棲動(dòng)物，1998年被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物[1]。我國(guó)大鯢主要分布在陜西、江西、湖北、四川等17個(gè)省（區(qū)）深山峽谷的溪流當(dāng)中[1-3]。中國(guó)大鯢是肉食性捕食動(dòng)物，野生大鯢捕食的動(dòng)物有螃蟹、昆蟲(chóng)、青蛙、魚(yú)等[4-5]。由于大鯢具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，其人工養(yǎng)殖逐漸得到了重視，目前在陜西漢中、四川巴中等地區(qū)出現(xiàn)了較大規(guī)模的養(yǎng)殖。

動(dòng)物腸道寄生著大量的微生物，這些微生物同時(shí)也是動(dòng)物體的組成部分，腸道微生物與寄主消化吸收及健康狀況密切相關(guān)[6-8]。腸道是一個(gè)相對(duì)密閉的系統(tǒng)，其內(nèi)部生長(zhǎng)的微生物以厭氧或兼性厭氧的微生物為主，采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法分離依然是腸道微生物研究的主要方法之一，有報(bào)道稱傳統(tǒng)方法分離到的微生物物種只有微生物總量的1%～5%，而其余95%～99%的微生物種群還未被分離和識(shí)別[9]。免培養(yǎng)方法是一種基于分子生物學(xué)的方法，與傳統(tǒng)的分離鑒定方法完全不同，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)[10]。該方法利用分子生物學(xué)技術(shù)判斷微生物的種類(lèi)及各個(gè)物種之間的親緣關(guān)系，其缺點(diǎn)是無(wú)法獲取微生物[11-12]。人工養(yǎng)殖由于其養(yǎng)殖密度高致使大鯢容易出現(xiàn)傳染性病害，部分傳染病與腸道微生物密切相關(guān)，因此研究養(yǎng)殖大鯢腸道微生物多樣性對(duì)人工飼養(yǎng)大鯢保護(hù)工作具有理論價(jià)值。本研究利用純培養(yǎng)及免培養(yǎng)2種方法對(duì)養(yǎng)殖大鯢的腸道微生物多樣性進(jìn)行研究，以期為大鯢保護(hù)工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 養(yǎng)殖大鯢采自陜西理工大學(xué)大鯢研究所大鯢養(yǎng)殖室，樣本共10條，平均體質(zhì)量6.76 kg，解剖后取完整消化道放入4 ℃的冰箱中保存，2周內(nèi)處理完。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)（江蘇蘇州凈化設(shè)備有限公司），高壓滅菌器（美國(guó)Stik公司），凝膠掃描成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），PCR擴(kuò)增儀（英國(guó)Techen公司），高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），移液器（Eppendorf公司），恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），超低溫冰箱（日本Panasonic公司），核酸測(cè)定儀（Eppendorf公司），超純水凈化系統(tǒng)（上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司）。

1.1.3 主要試劑 Fast DNA Spin Kit For Feces（美國(guó)Mo Bio公司），2×Taq PCR Kit（Takara公司），2×HieffTM PCR Master Mix（Takara公司），高效感受態(tài)DH5α（Escherichia coli competent cells，DH5α）（上海Sangon公司），pMDTM19-T Vocter Cloning Kit（Takara公司），Spin柱式DNA回收試劑盒（Biofulx公司），PCR引物（上海Sangon公司），Hae Ⅲ（Takara公司），Ampicillin（上海Sangon公司），Trytone（Oxoid公司），Yeast Extract（Oxoid公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大鯢腸道細(xì)菌純培養(yǎng) 純培養(yǎng)腸道細(xì)菌分離，按照文獻(xiàn)[13]報(bào)道方法進(jìn)行。將大鯢腸道內(nèi)容物稀釋涂布于牛肉膏蛋白胨平板，37 ℃培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行純化并保藏菌種于4 ℃冰箱中。

1.2.2 對(duì)大鯢腸道純培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分子鑒定 純培養(yǎng)腸道細(xì)菌DNA擴(kuò)增，參照文獻(xiàn)[14]報(bào)道方法進(jìn)行。進(jìn)行菌液16S rRNA擴(kuò)增，選用引物799F：5′-AACAGGATTAGATACCCT G-3′/1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行擴(kuò)增，長(zhǎng)度750 bp左右。反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min;55 ℃ 0.5 min;72 ℃ 1 min，33 個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用的瓊脂糖電泳檢測(cè)后送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，結(jié)果整理后提交NCBI申請(qǐng)大鯢腸道細(xì)菌菌株16S rRNA基因序列登錄號(hào)。

1.2.3 大鯢腸道內(nèi)容物中微生物總DNA提取及16S rRNA擴(kuò)增 解剖大鯢后將其腸道內(nèi)容物收集到滅菌的1.5 mL EP管中。總DNA的提取使用美國(guó)Mo Bio公司生產(chǎn)的糞便基因組提取試劑盒。按照試劑盒說(shuō)明提取DNA后將其干燥，加入20 μL TE緩沖液溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩？侱NA特異性擴(kuò)增，參照純培養(yǎng)腸道細(xì)菌擴(kuò)增方法進(jìn)行。

1.2.4 克隆文庫(kù)的構(gòu)建及陽(yáng)性克隆的篩選 用Sanprep柱式DNA膠回收試劑盒將擴(kuò)增后750 bp左右的目的條帶切膠純化回收。純化產(chǎn)物與pMDTM19-T Vocter連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。陽(yáng)性克隆子的初步篩選參照文獻(xiàn)[15]，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布含氨芐青霉素（100 mg/L）、X-gal、IPTG的LB瓊脂平板37 ℃避光培養(yǎng) 14～16 h進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。對(duì)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物選用限制性核酸內(nèi)切酶Hae Ⅲ對(duì)目標(biāo)插入片段多態(tài)性分析（PCR-RFLP）后進(jìn)行測(cè)序。將Hae Ⅲ酶切帶譜分析不同，且測(cè)序結(jié)果也不同的克隆歸為1個(gè)OTU。克隆文庫(kù)覆蓋率統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用公式：C=[1-（n/N）]×100%[16]，這里n代表在16S rRNA基因克隆文庫(kù)僅出現(xiàn)1次的OTU的數(shù)量，N代表16S rRNA基因克隆文庫(kù)的總數(shù)。

1.2.5 免培養(yǎng)獲取細(xì)菌及克隆文庫(kù)發(fā)育分析 免培養(yǎng)獲取的測(cè)序結(jié)果及克隆文庫(kù)獲取的細(xì)菌測(cè)序結(jié)果用Vector Screen去除載體序列后提交到EzTaxon-eserver（http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net）進(jìn)行BLAST檢索，下載同源性較高的模式菌株的數(shù)據(jù)，生成Fasta格式文件。用ClustalX軟件對(duì)所得序列進(jìn)行人工校正及比對(duì)分析。利用Mega 5.02，按照Neighbor-Joining法聚類(lèi)，選擇1 000個(gè)重復(fù)做Bootstrap值分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。所得的16S rRNA基因序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，申請(qǐng)16S rRNA基因序列登錄號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢腸道細(xì)菌純培養(yǎng)

2.1.1 大鯢腸道細(xì)菌純培養(yǎng)分離 經(jīng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，獲取103株純細(xì)菌。對(duì)獲取細(xì)菌菌株進(jìn)行保藏，待分析鑒定。

2.1.2 大鯢腸道純培養(yǎng)細(xì)菌分子生物學(xué)的鑒定 應(yīng)用細(xì)菌16S rRNA通用引物799F和1492R對(duì)分離得到的細(xì)菌進(jìn)行菌液PCR，得到約750 bp清晰的片段（圖1）。可見(jiàn)PCR產(chǎn)物條帶清晰，產(chǎn)物量大，可用于測(cè)序反應(yīng)。將750 bp的清晰條帶所對(duì)應(yīng)的的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，成功測(cè)通103個(gè)序列。序列整理后提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中NCBI并獲得養(yǎng)殖大鯢純培養(yǎng)腸道細(xì)菌保守區(qū)基因登錄號(hào)。獲取登陸號(hào)為KU872287-KU872389。

2.2 大鯢腸道免純培養(yǎng)及鑒定

2.2.1 腸道內(nèi)容物總DNA提取及16S rRNA擴(kuò)增 參照糞便總DNA提取試劑盒的步驟，提取野生大鯢腸道內(nèi)容物總DNA。0.9%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。提取大鯢腸道微生物的總DNA較完整，條帶較為清晰，可用于下游試驗(yàn)。應(yīng)用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，得到約 750 bp 的目標(biāo)片段見(jiàn)圖3。另外還可看到位于100～200 bp之間較清楚的條帶，推測(cè)可能為PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度不合適導(dǎo)致大量引物二聚體產(chǎn)生的基因片段。切膠純化回收位于750 bp的目標(biāo)條帶可避免其影響。

2.2.2 克隆文庫(kù)的構(gòu)建及陽(yáng)性克隆的篩選 將上述750 bp處PCR產(chǎn)物切膠回收后鏈接pMD-19T載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建基因克隆文庫(kù)后獲取191個(gè)陽(yáng)性克隆，以質(zhì)粒通用引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用Hae Ⅲ進(jìn)行插入目的片段的RFLP分析，初步獲取酶切帶譜不同的克隆后選擇105個(gè)樣品送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果去除嵌合序列，并排除重復(fù)序列后共得到15個(gè)OTUs（代表100個(gè)有效序列）。根據(jù)公式，計(jì)算得克隆文庫(kù)的覆蓋率C為 85.00%，可以代表大鯢腸道內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。

2.3 細(xì)菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 大鯢腸道純培養(yǎng)細(xì)菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 純培養(yǎng)獲得103個(gè)菌株，成功測(cè)通9個(gè)序列。整理后提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，去除嵌合體后得到93條有效序列，登錄號(hào)為KU872251-KU872389，進(jìn)行BLAST檢索對(duì)比，所得到細(xì)菌16S rRNA序列如下：變形菌門(mén)（Proteobacteria）85株，占總細(xì)菌分離數(shù)87.63%，其中愛(ài)德華氏菌屬（Edwardsiella sp.）27株，占總數(shù)的27.81%，志賀氏菌屬（Shigella sp.）11株占總數(shù)的11.34%，沙雷氏菌屬（Serratia sp.）5株，占總數(shù)的 5.15%，其中埃希氏菌屬（Escherichia sp.）8株，占總數(shù)的8.25%，沙門(mén)氏菌屬（Salmonella sp.）2株，占總數(shù)的2.06%，肥桿菌屬（Obesumbacterium sp.）1株，占總數(shù)的1.03%，鄰單胞菌屬（Plesiomonas sp.）2株，占總數(shù)的2.06%，耶爾辛氏菌屬（Yersinia sp.）1株，占總數(shù)的1.03%，腸桿菌屬（Enterobacter sp.）1株，占總數(shù)的1.03%，孤菌屬（Vibrio sp.）4株，占總數(shù)的4.12%，克呂沃氏菌屬（Kluyvera sp.）1株，占總數(shù)的1.03%，克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）3株，占總數(shù)的3.09%，氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）17株，占總數(shù)的17.53%，假單胞菌（Pseudomona sp.）2株，占總數(shù)的2.06%;厚壁菌門(mén)（Firmicutes）占總分離數(shù)5.15%，芽孢桿菌屬（Bacilli sp.）5株，占總數(shù)的 5.15%;放線菌門(mén)（Actinobacteria）7株，占總數(shù)的7.22%，其中短桿菌屬（Brevibacterium sp.）7株，占總數(shù)的7.22%。

依據(jù)16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），變形菌門(mén)（Proteobacteria）作為優(yōu)勢(shì)種群，其序列集中在1個(gè)大的分支上，而這一分支又分為多個(gè)小分支。志賀氏菌屬（Shigella sp.）、埃希氏菌屬（Escherichia sp.）、沙門(mén)氏菌屬（Salmonella sp.）在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚為一族。沙雷氏菌屬（Serratia sp.）及腸桿菌屬（Enterobacter sp.）相似性較高，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚為一族。愛(ài)德華氏菌屬（Edwardsiella sp.）與肥桿菌屬（Obesumbacterium sp.）相似性較高，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚為一族。孤菌屬（Vibrio sp.）與氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）中的大部分相似性較高，聚為一族。厚壁菌門(mén)（Firmicutes）中的短桿菌屬（Brevibacterium sp.）占據(jù)了進(jìn)化樹(shù)的一個(gè)獨(dú)立分支。放線菌門(mén)（Actinobacteria）中的短桿菌屬（Brevibacterium sp.）占據(jù)了進(jìn)化樹(shù)的一個(gè)獨(dú)立分支。

2.3.2 大鯢腸道免培養(yǎng)細(xì)菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 將測(cè)序的105條有效序列，整理后提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，取除嵌合體序列獲得100個(gè)養(yǎng)殖大鯢免培養(yǎng)腸道細(xì)菌登錄號(hào)：KU872390-KU872489。由表2可知，進(jìn)行BLAST檢索后，陽(yáng)性克隆單元序列（operational taxonomic units，OTU）如下：變形菌門(mén)（Proteobacteria）75株，占總克隆數(shù)的71.43%，其中埃希氏菌屬（Escherichia sp.）29單元，占總數(shù)的27.62%，志賀氏菌屬（Shigella sp.）30單元，占總數(shù)的28.57%，沙雷氏菌屬（Serratia）3單元，占總數(shù)的2.86%，耶爾辛氏菌屬（Yersinia sp.）2單元，占總數(shù)的1.90%，食堿菌屬（Alcanivorax sp.）7單元，占總數(shù)的6.67%，沙門(mén)氏菌屬（Salmonella sp.）1單元，占總數(shù)的0.10%，哈夫尼菌屬（Hafnia sp.）1單元，占總數(shù)的 0.10%，希萬(wàn)氏菌屬（Shewanella sp.）1單元，占總數(shù)的 0.10%，布丘氏菌屬（Buttiauxella sp.）1單元，占總數(shù)的 0.10%;放線菌門(mén)（Actinobacteria）21株，占總克隆數(shù)的 20.01%，其中短桿菌屬（Brevibacterium sp.）19單元，占總數(shù)的18.10%，戈登氏桿菌屬（Gordonibacter sp.）1單元，占總數(shù)的0.10%，紅蝽?xiàng)U菌屬（Coriobacterium sp.）1單元，占總數(shù)的 0.10%;厚壁菌門(mén)（Firmicutes）8株，占總克隆數(shù)的7.62%，其中芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）7單元，占總數(shù)的6.67%，葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）1單元，占總數(shù)的0.10%;擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）占總克隆數(shù)的0.95%，其中理研菌屬（Rikenella sp.）1單元，占總數(shù)的0.10%。

依據(jù)16S rRNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5），可見(jiàn)進(jìn)化樹(shù)明顯分為4個(gè)大的分支，第1個(gè)分支中主要包含了變形菌門(mén)（Proteobacteria）大部分種屬;第2個(gè)分支主要包含了放線菌門(mén)（Actinobacteria）的大部分種屬;第3個(gè)分支只有1個(gè)屬，是擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）的理研菌屬（Rikenella sp.）;第4個(gè)分支主要包含了厚壁菌門(mén)（Firmicutes）的大部分種屬。

3 討論與結(jié)論

本研究采用純培養(yǎng)及免培養(yǎng)方法對(duì)養(yǎng)殖大鯢腸道細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法獲取103株細(xì)菌，分子生物學(xué)方法鑒定為3門(mén)16個(gè)分類(lèi)單元。免培養(yǎng)方法獲取105條序列，經(jīng)NCBI上BLAST比對(duì)后，鑒定為4門(mén)15個(gè)分類(lèi)單元。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用免培養(yǎng)技術(shù)對(duì)野生大鯢腸道細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，野生大鯢腸道細(xì)菌免培養(yǎng)獲得分4個(gè)門(mén)：變形菌門(mén)（Proteobacteria）占總克隆數(shù)的92.08%，梭菌門(mén)（Clostridia）、衣原體門(mén)（Chlamydiae）、芽孢菌門(mén)各占總克隆數(shù)的1.98%， 其中變形菌門(mén)為最優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，另外還存在1.98%

細(xì)菌未確定到屬[15-16]。本研究中養(yǎng)殖大鯢腸道純培養(yǎng)細(xì)菌共分離的103株細(xì)菌可分為3個(gè)門(mén)16個(gè)屬，在門(mén)的分類(lèi)上優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門(mén)（Proteobacteria），占87.63%，其次為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）;免培養(yǎng)獲取105條細(xì)菌克隆序列可分為4個(gè)門(mén)15個(gè)屬，在門(mén)的分類(lèi)上，優(yōu)勢(shì)菌株為變形菌門(mén)（Proteobacteria），占總克隆數(shù)的71.43%。可見(jiàn)野生大鯢與養(yǎng)殖大鯢腸道細(xì)菌在門(mén)一級(jí)分類(lèi)中最優(yōu)勢(shì)類(lèi)群均為變形菌門(mén)。在屬這一級(jí)分類(lèi)上野生大鯢最優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）占總細(xì)菌數(shù) 66.34%;養(yǎng)殖大鯢免培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)埃希氏菌屬（Escherichia sp.）29單元占總數(shù)的27.62%，志賀氏菌屬（Shigella sp.）30單元占總數(shù)的28.57%，這2個(gè)屬數(shù)量基本相當(dāng)，同為最優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群;純培養(yǎng)養(yǎng)殖大鯢腸道細(xì)菌最優(yōu)勢(shì)菌群為愛(ài)德華氏菌屬（Edwardsiella sp.）占總數(shù)的27.81%。可見(jiàn)在屬一級(jí)分類(lèi)上野生與養(yǎng)殖大鯢腸道細(xì)菌最優(yōu)勢(shì)菌群差異較大，這可能與大鯢的生活環(huán)境、攝食的物種種類(lèi)等有一定的關(guān)系。野生大鯢生活在環(huán)境溫度較低的山澗溪流中，以小型水生動(dòng)物及昆蟲(chóng)等為食，食性相對(duì)比較復(fù)雜，而本試驗(yàn)所用養(yǎng)殖大鯢以小鯽魚(yú)為食，食性相對(duì)單一，環(huán)境也單一。

大鯢為雖然是兩棲類(lèi)動(dòng)物，但其一般都生活在水里，很少出水活動(dòng)，所以大鯢生活環(huán)境與水生動(dòng)物更相近。經(jīng)比較中華絨螯蟹（Brachyura）腸道細(xì)菌研究[17]，東方鲀（tetraodon fluviatilis）腸道細(xì)菌[18]，南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei Boone）腸道細(xì)菌[19]與本研究大鯢（Andrias davidianus）腸道細(xì)菌多樣性的差異，可知它們的腸道細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群都是變形菌門(mén)（Proteobacteria）;而陸生環(huán)境中的揚(yáng)州鵝[20]、牛[21]、豬[22]等動(dòng)物都是厚壁菌門(mén)（Firmicutes）為優(yōu)勢(shì)群落。可見(jiàn)環(huán)境對(duì)腸道細(xì)菌多樣性的影響是明顯的。

養(yǎng)殖大鯢腸道細(xì)菌多樣性豐富，基于純培養(yǎng)技術(shù)可將養(yǎng)殖大鯢腸道細(xì)菌歸為3門(mén)16屬，免培養(yǎng)技術(shù)可將養(yǎng)殖大鯢腸道細(xì)菌歸為4門(mén)15屬。養(yǎng)殖大鯢腸道細(xì)菌多樣性研究純培養(yǎng)技術(shù)與免培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)果表明在門(mén)的差異性較小，在屬的差異性較大。就純培養(yǎng)技術(shù)比較養(yǎng)殖與野生大鯢腸道細(xì)菌在屬的分類(lèi)上差異性很大。就免培養(yǎng)技術(shù)比較養(yǎng)殖與野生大鯢腸道細(xì)菌差異性在門(mén)與屬的分類(lèi)上都很大。

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