黃鱔醛酮還原酶對(duì)大腸桿菌非生物脅迫耐受性的影響

闞延澤 江翱 王全禾

摘要：醛酮還原酶是一類依賴NAD（P）H的氧化還原酶，在生物體內(nèi)參與了糖代謝、酮代謝和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N生理過(guò)程。為了解黃鱔醛酮還原酶在細(xì)胞逆境脅迫中的保護(hù)作用，采用液體培養(yǎng)和斑點(diǎn)展示法，比較含黃鱔醛酮還原酶Eakr的重組菌株和陰性對(duì)照菌株在NaCl、Cu2+和H2O2等非生物脅迫下的存活率和生長(zhǎng)活力。結(jié)果表明，含重組醛酮還原酶Eakr的大腸桿菌在高滲透壓、重金屬和氧化脅迫下的生存率顯著高于陰性對(duì)照，其生存活力也大大增強(qiáng)。提示黃鱔醛酮還原酶Eakr可能參與了細(xì)胞活性氧代謝和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N生理過(guò)程。

關(guān)鍵詞：醛酮還原酶;非生物脅迫;存活率;耐受性

中圖分類號(hào)： S188+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）01-0159-03

醛酮還原酶（aldo keto reductase，AKR）是一類通過(guò)與輔酶NAD（P）H結(jié)合將醛酮類物質(zhì)還原為相應(yīng)醇類的的氧化還原酶。它包括16 個(gè)家族，近200個(gè)成員，在酵母、植物、哺乳動(dòng)物以及原核生物中均有報(bào)道 [1]。醛酮還原酶既參與了人類細(xì)胞對(duì)外源、內(nèi)源性毒性物質(zhì)的代謝過(guò)程，也導(dǎo)致了某些重要疾病的發(fā)生與發(fā)展[2]。人類醛酮還原酶AKR7A家族的成員不僅能夠抵抗活性醛類物質(zhì)氧化毒害的作用[3]，而且還參與了活性氧代謝，是機(jī)體重要的防御酶[4-5];相反，胰臟腫瘤細(xì)胞中AKR1B10基因被抑制后可有效抑制腫瘤細(xì)胞癌變，提示AKR1B10可能參與了腫瘤形成的過(guò)程[6]。除此以外，AKRs還可以催化視黃醛還原成視黃醇，影響生物體視覺的形成[7]，并且在維持膜電位、細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡以及物質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)确矫姘缪葜匾慕巧玔8]。植物和微生物中發(fā)現(xiàn)的醛酮還原酶似乎還是機(jī)體抵抗干旱、鹽脅迫和重金屬等非生物脅迫的重要因子[9-10]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于魚類醛酮還原酶功能的研究相對(duì)貧乏。代海艷等初步探討了黃鱔醛酮還原酶的羰基解毒作用，發(fā)現(xiàn)該酶可有效降低丙酮醛和2，3-丁二酮等羰基化合物的毒害作用[11]。但對(duì)其是否參與了細(xì)胞重金屬代謝、鹽離子脅迫和活性氧代謝等過(guò)程尚不甚清楚。本研究擬通過(guò)對(duì)比含黃鱔醛酮還原酶Eakr菌株和空白質(zhì)粒菌株，在高滲透壓、重金屬和氧化3種逆境脅迫處理下的存活率及生長(zhǎng)活力差異，分析黃鱔醛酮還原酶在細(xì)胞非生物脅迫中的保護(hù)作用，為深入了解黃鱔醛酮還原酶的生物學(xué)功能提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株與試劑

供試菌株含pET-28a-Eakr重組質(zhì)粒BL21菌株和 pET-28a空質(zhì)粒BL21菌株，均由長(zhǎng)江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所保存。抗生素、CuSO4、NaCl和H2O2等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè) 該試驗(yàn)于2016—2017年在長(zhǎng)江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所動(dòng)物基因組研究室完成，將實(shí)驗(yàn)室保存的pET-28a-Eakr重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆菌株在LB平板（含50 g/mL Kana）上劃線，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。在平板上挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基（含50 g/mL Kana）中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)。待培養(yǎng)D600 nm值至約0.6時(shí)，加入終濃度為 0.1 mmol/L 的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。使用12%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白是否表達(dá)。

1.2.2 不同脅迫因子處理及存活率、生長(zhǎng)活力展示 首先，用LB培養(yǎng)基將pET-28a-Eakr重組質(zhì)粒菌株培養(yǎng)至D600 nm至約為0.6時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng) 4 h。取6個(gè)EP管，各加入1 mL誘導(dǎo)后菌液，同時(shí)加入NaCl，使NaCl終濃度分別為0、50、100、150、200、250 mmol/L，37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)1 h。離心收集菌體，用滅菌水洗滌菌體后，使用1 mL新鮮LB重懸。取10 μL菌液進(jìn)行101、102、103、104、105、106……倍梯度稀釋。取50 μL稀釋后的菌液，均勻涂在LB平板（含50 μg/mL Kana）上，于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng) 12 h。選擇菌落數(shù)目在500 以內(nèi)的平板，用菌落分析儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算不同濃度NaCl處理后大腸桿菌的存活個(gè)數(shù)。存活率Sr=（非生物脅迫后菌落總數(shù)/空白對(duì)照菌落總數(shù)）×100%。

斑點(diǎn)展示法表征菌落生長(zhǎng)活力：將不同脅迫條件處理后的菌液進(jìn)行1倍、10倍、100倍、1 000倍稀釋，取5 μL點(diǎn)在LB平板（含 50 μg/mL Kana）上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后將平板放入菌落分析儀中拍照并保存。將含pET-28a空質(zhì)粒菌株（WT）做以上相同處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。

同樣采用類似方法進(jìn)行CuSO4、H2O2的液體培養(yǎng)和斑點(diǎn)形成展示。CuSO4脅迫處理終濃度為0、2、4、6、8、10 mmol/L，H2O2脅迫處理終濃度為0、1、2、4、8、16 mmol/L。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，存活率均用“ x±s”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，含pET-28a-Eakr BL21陽(yáng)性菌株經(jīng)誘導(dǎo)后可檢測(cè)到分子量約為38 ku的特異條帶，大小與預(yù)測(cè)Eakr分子量相符，空質(zhì)粒菌株誘導(dǎo)后未檢測(cè)到類似分子量蛋白表達(dá)。證明Eakr在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá) （圖1）。

2.2 非生物脅迫對(duì)Eakr表達(dá)菌生長(zhǎng)的影響

將Eakr表達(dá)菌株和空白質(zhì)粒菌株同時(shí)進(jìn)行NaCl脅迫處理，通過(guò)菌落計(jì)數(shù)儀記錄存活菌落數(shù)目，計(jì)算存活率并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。高鹽環(huán)境嚴(yán)重影響大腸桿菌的存活率，隨著NaCl濃度的升高，空白質(zhì)粒菌株的存活率顯著降低，Eakr表達(dá)菌株存活率變化較小。當(dāng)NaCl濃度≥100 mmol/L時(shí)，Eakr表達(dá)菌株和空白質(zhì)粒菌株存活率差異顯著。當(dāng)NaCl濃度為 250 mmol/L 時(shí)Eakr表達(dá)菌株的存活率約為空白質(zhì)粒菌株的20倍（圖2）。斑點(diǎn)展示結(jié)果表明，不同濃度的NaCl脅迫對(duì)Eakr表達(dá)菌株生長(zhǎng)影響較小，但對(duì)空白質(zhì)粒菌株影響顯著。Eakr表達(dá)菌株的生長(zhǎng)活力明顯優(yōu)于空白質(zhì)粒菌株。這與NaCl脅迫下存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果吻合。說(shuō)明Eakr可以提高大腸桿菌對(duì)高滲透壓脅迫的耐受性（圖3）。

Cu2+脅迫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著Cu2+濃度的不斷升高，Eakr表達(dá)菌株和空白質(zhì)粒菌株的存活率均有下降，但空白質(zhì)粒菌株存活率下降得更為顯著，且Eakr表達(dá)菌株的存活率均高于空白質(zhì)粒菌株。當(dāng)Cu2+濃度≥4 mmol/L時(shí)，Eakr表達(dá)菌株的存活率遠(yuǎn)高于空白質(zhì)粒菌株的存活率，且差異極顯著。在Cu2+濃度為10 mmol/L時(shí)，Eakr表達(dá)菌株的存活率為空白質(zhì)粒菌株存活率的500倍（圖4）。斑點(diǎn)展示結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，不同濃度Cu2+脅迫下，Eakr表達(dá)菌株均比空白質(zhì)粒菌株生長(zhǎng)旺盛，當(dāng)Cu2+濃度>8 mmol/L時(shí)，空白質(zhì)粒菌株已無(wú)明顯菌落，但Eakr表達(dá)菌株仍有部分存活，這與Cu2+脅迫下存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致（圖5）。說(shuō)明Eakr的表達(dá)可提高大腸桿菌對(duì)耐Cu2+脅迫的耐受性。

比較Eakr表達(dá)菌株和空白質(zhì)粒菌株在不同濃度H2O2脅迫下的存活率發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2濃度的不斷升高，Eakr表達(dá)菌株和空白質(zhì)粒菌株的存活率均有下降，但空白質(zhì)粒菌株存活率下降得更為顯著，且Eakr表達(dá)菌株的存活率均高于空白質(zhì)粒菌株。在H2O2濃度為16 mmol/L時(shí)，Eakr表達(dá)菌株的存活率為空白質(zhì)粒菌株存活率的40倍（圖6）。Eakr表達(dá)菌株和空白質(zhì)粒菌株在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)也存在明顯差異，在不同濃度H2O2下Eakr表達(dá)菌株均比空白質(zhì)粒菌株生長(zhǎng)茂盛，在H2O2濃度≥8 mmol/L時(shí)空白質(zhì)粒菌株已無(wú)明顯菌落，但Eakr表達(dá)菌株的菌落基本完整（圖7）。說(shuō)明Eakr的表達(dá)可以顯著提高大腸桿菌對(duì)氧化脅迫的耐受性。

3 討論和結(jié)論

醛酮還原酶廣泛分布于原核和真核生物中，具有多種生物學(xué)功能[12]。大部分AKR都能以醛類物質(zhì)作為底物[13]，是一類重要的解毒酶[14]。人類肝臟AKR7A可以代謝黃曲霉素等強(qiáng)致癌物質(zhì)，在肝臟抗氧化過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[4];藍(lán)藻醛酮還原酶基因AKR3G1能夠催化還原脂質(zhì)氧化過(guò)程中產(chǎn)生的有毒羰基化合物[15];野生大麥表達(dá)外源基因擬南芥AKR4C9時(shí)，可以顯著提高對(duì)重金屬鉻和鹽脅迫的耐受性[16];同時(shí)在大腸桿菌中表達(dá)醛酮還原酶基因ALDRXV4，顯著提高了對(duì)高鹽、高滲透壓、重金屬和醛類物質(zhì)等非生物脅迫環(huán)境下

的耐受性[9];醛酮還原酶AKR17A1在大腸桿菌中表達(dá)，顯著提高了大腸桿菌對(duì)鎘、砷、干旱、鹽及高溫等非生物脅迫下的耐受性[17]，以上研究均顯示，醛酮還原酶在細(xì)胞非生物脅迫中起到關(guān)鍵保護(hù)作用。筆者的研究結(jié)果也證實(shí)，重組黃鱔醛酮還原酶Eakr賦予重組大腸桿菌較強(qiáng)的抗高滲透壓、氧化脅迫及重金屬傷害的能力。在Eakr的保護(hù)下，大腸桿菌在NaCl、Cu2+和H2O2脅迫中的生存率分別提高了20、500、40倍。這些結(jié)果提示，黃鱔體內(nèi)的醛酮還原酶可能也是一種重要的機(jī)體抵御脅迫危害的保護(hù)酶。但Eakr在生物體內(nèi)的具體作用及調(diào)控機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步深入研究。筆者的研究為魚類醛酮還原酶的生物學(xué)功能研究提供了參考資料。

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