黃鱔醛酮還原酶對大腸桿菌非生物脅迫耐受性的影響

闞延澤 江翱 王全禾

摘要：醛酮還原酶是一類依賴NAD（P）H的氧化還原酶，在生物體內參與了糖代謝、酮代謝和物質運輸等多種生理過程。為了解黃鱔醛酮還原酶在細胞逆境脅迫中的保護作用，采用液體培養和斑點展示法，比較含黃鱔醛酮還原酶Eakr的重組菌株和陰性對照菌株在NaCl、Cu2+和H2O2等非生物脅迫下的存活率和生長活力。結果表明，含重組醛酮還原酶Eakr的大腸桿菌在高滲透壓、重金屬和氧化脅迫下的生存率顯著高于陰性對照，其生存活力也大大增強。提示黃鱔醛酮還原酶Eakr可能參與了細胞活性氧代謝和物質運輸等多種生理過程。

關鍵詞：醛酮還原酶;非生物脅迫;存活率;耐受性

中圖分類號： S188+.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0159-03

醛酮還原酶（aldo keto reductase，AKR）是一類通過與輔酶NAD（P）H結合將醛酮類物質還原為相應醇類的的氧化還原酶。它包括16 個家族，近200個成員，在酵母、植物、哺乳動物以及原核生物中均有報道 [1]。醛酮還原酶既參與了人類細胞對外源、內源性毒性物質的代謝過程，也導致了某些重要疾病的發生與發展[2]。人類醛酮還原酶AKR7A家族的成員不僅能夠抵抗活性醛類物質氧化毒害的作用[3]，而且還參與了活性氧代謝，是機體重要的防御酶[4-5];相反，胰臟腫瘤細胞中AKR1B10基因被抑制后可有效抑制腫瘤細胞癌變，提示AKR1B10可能參與了腫瘤形成的過程[6]。除此以外，AKRs還可以催化視黃醛還原成視黃醇，影響生物體視覺的形成[7]，并且在維持膜電位、細胞內外滲透壓平衡以及物質跨膜運輸等方面扮演重要的角色[8]。植物和微生物中發現的醛酮還原酶似乎還是機體抵抗干旱、鹽脅迫和重金屬等非生物脅迫的重要因子[9-10]。目前，國內外對于魚類醛酮還原酶功能的研究相對貧乏。代海艷等初步探討了黃鱔醛酮還原酶的羰基解毒作用，發現該酶可有效降低丙酮醛和2，3-丁二酮等羰基化合物的毒害作用[11]。但對其是否參與了細胞重金屬代謝、鹽離子脅迫和活性氧代謝等過程尚不甚清楚。本研究擬通過對比含黃鱔醛酮還原酶Eakr菌株和空白質粒菌株，在高滲透壓、重金屬和氧化3種逆境脅迫處理下的存活率及生長活力差異，分析黃鱔醛酮還原酶在細胞非生物脅迫中的保護作用，為深入了解黃鱔醛酮還原酶的生物學功能提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與試劑

供試菌株含pET-28a-Eakr重組質粒BL21菌株和 pET-28a空質粒BL21菌株，均由長江大學生物醫藥研究所保存。抗生素、CuSO4、NaCl和H2O2等均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白的誘導表達檢測 該試驗于2016—2017年在長江大學生物醫藥研究所動物基因組研究室完成，將實驗室保存的pET-28a-Eakr重組質粒陽性克隆菌株在LB平板（含50 g/mL Kana）上劃線，37 ℃過夜培養。在平板上挑取單菌落于LB液體培養基（含50 g/mL Kana）中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養。待培養D600 nm值至約0.6時，加入終濃度為 0.1 mmol/L 的IPTG，37 ℃誘導培養4 h。使用12%的SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白是否表達。

1.2.2 不同脅迫因子處理及存活率、生長活力展示 首先，用LB培養基將pET-28a-Eakr重組質粒菌株培養至D600 nm至約為0.6時，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導培養 4 h。取6個EP管，各加入1 mL誘導后菌液，同時加入NaCl，使NaCl終濃度分別為0、50、100、150、200、250 mmol/L，37 ℃ 150 r/min培養1 h。離心收集菌體，用滅菌水洗滌菌體后，使用1 mL新鮮LB重懸。取10 μL菌液進行101、102、103、104、105、106……倍梯度稀釋。取50 μL稀釋后的菌液，均勻涂在LB平板（含50 μg/mL Kana）上，于37 ℃培養箱中恒溫培養 12 h。選擇菌落數目在500 以內的平板，用菌落分析儀進行計數。根據稀釋倍數，計算不同濃度NaCl處理后大腸桿菌的存活個數。存活率Sr=（非生物脅迫后菌落總數/空白對照菌落總數）×100%。

斑點展示法表征菌落生長活力：將不同脅迫條件處理后的菌液進行1倍、10倍、100倍、1 000倍稀釋，取5 μL點在LB平板（含 50 μg/mL Kana）上，于37 ℃培養箱中培養，12 h后將平板放入菌落分析儀中拍照并保存。將含pET-28a空質粒菌株（WT）做以上相同處理，每個處理重復3次。

同樣采用類似方法進行CuSO4、H2O2的液體培養和斑點形成展示。CuSO4脅迫處理終濃度為0、2、4、6、8、10 mmol/L，H2O2脅迫處理終濃度為0、1、2、4、8、16 mmol/L。

1.2.3 數據處理與分析 采用SPSS 20.0 進行數據處理和統計學分析，存活率均用“ x±s”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE檢測誘導表達結果

SDS-PAGE凝膠電泳檢測結果顯示，含pET-28a-Eakr BL21陽性菌株經誘導后可檢測到分子量約為38 ku的特異條帶，大小與預測Eakr分子量相符，空質粒菌株誘導后未檢測到類似分子量蛋白表達。證明Eakr在大腸桿菌中實現了高效表達 （圖1）。

2.2 非生物脅迫對Eakr表達菌生長的影響

將Eakr表達菌株和空白質粒菌株同時進行NaCl脅迫處理，通過菌落計數儀記錄存活菌落數目，計算存活率并進行數據處理。高鹽環境嚴重影響大腸桿菌的存活率，隨著NaCl濃度的升高，空白質粒菌株的存活率顯著降低，Eakr表達菌株存活率變化較小。當NaCl濃度≥100 mmol/L時，Eakr表達菌株和空白質粒菌株存活率差異顯著。當NaCl濃度為 250 mmol/L 時Eakr表達菌株的存活率約為空白質粒菌株的20倍（圖2）。斑點展示結果表明，不同濃度的NaCl脅迫對Eakr表達菌株生長影響較小，但對空白質粒菌株影響顯著。Eakr表達菌株的生長活力明顯優于空白質粒菌株。這與NaCl脅迫下存活率統計結果吻合。說明Eakr可以提高大腸桿菌對高滲透壓脅迫的耐受性（圖3）。

Cu2+脅迫試驗發現，隨著Cu2+濃度的不斷升高，Eakr表達菌株和空白質粒菌株的存活率均有下降，但空白質粒菌株存活率下降得更為顯著，且Eakr表達菌株的存活率均高于空白質粒菌株。當Cu2+濃度≥4 mmol/L時，Eakr表達菌株的存活率遠高于空白質粒菌株的存活率，且差異極顯著。在Cu2+濃度為10 mmol/L時，Eakr表達菌株的存活率為空白質粒菌株存活率的500倍（圖4）。斑點展示結果進一步證實，不同濃度Cu2+脅迫下，Eakr表達菌株均比空白質粒菌株生長旺盛，當Cu2+濃度>8 mmol/L時，空白質粒菌株已無明顯菌落，但Eakr表達菌株仍有部分存活，這與Cu2+脅迫下存活率統計結果一致（圖5）。說明Eakr的表達可提高大腸桿菌對耐Cu2+脅迫的耐受性。

比較Eakr表達菌株和空白質粒菌株在不同濃度H2O2脅迫下的存活率發現，隨著H2O2濃度的不斷升高，Eakr表達菌株和空白質粒菌株的存活率均有下降，但空白質粒菌株存活率下降得更為顯著，且Eakr表達菌株的存活率均高于空白質粒菌株。在H2O2濃度為16 mmol/L時，Eakr表達菌株的存活率為空白質粒菌株存活率的40倍（圖6）。Eakr表達菌株和空白質粒菌株在培養基上的生長狀態也存在明顯差異，在不同濃度H2O2下Eakr表達菌株均比空白質粒菌株生長茂盛，在H2O2濃度≥8 mmol/L時空白質粒菌株已無明顯菌落，但Eakr表達菌株的菌落基本完整（圖7）。說明Eakr的表達可以顯著提高大腸桿菌對氧化脅迫的耐受性。

3 討論和結論

醛酮還原酶廣泛分布于原核和真核生物中，具有多種生物學功能[12]。大部分AKR都能以醛類物質作為底物[13]，是一類重要的解毒酶[14]。人類肝臟AKR7A可以代謝黃曲霉素等強致癌物質，在肝臟抗氧化過程中起到關鍵作用[4];藍藻醛酮還原酶基因AKR3G1能夠催化還原脂質氧化過程中產生的有毒羰基化合物[15];野生大麥表達外源基因擬南芥AKR4C9時，可以顯著提高對重金屬鉻和鹽脅迫的耐受性[16];同時在大腸桿菌中表達醛酮還原酶基因ALDRXV4，顯著提高了對高鹽、高滲透壓、重金屬和醛類物質等非生物脅迫環境下

的耐受性[9];醛酮還原酶AKR17A1在大腸桿菌中表達，顯著提高了大腸桿菌對鎘、砷、干旱、鹽及高溫等非生物脅迫下的耐受性[17]，以上研究均顯示，醛酮還原酶在細胞非生物脅迫中起到關鍵保護作用。筆者的研究結果也證實，重組黃鱔醛酮還原酶Eakr賦予重組大腸桿菌較強的抗高滲透壓、氧化脅迫及重金屬傷害的能力。在Eakr的保護下，大腸桿菌在NaCl、Cu2+和H2O2脅迫中的生存率分別提高了20、500、40倍。這些結果提示，黃鱔體內的醛酮還原酶可能也是一種重要的機體抵御脅迫危害的保護酶。但Eakr在生物體內的具體作用及調控機制尚不明確，需要進一步深入研究。筆者的研究為魚類醛酮還原酶的生物學功能研究提供了參考資料。

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