不同鹽度下5種中草藥對2種水產動物致病菌的抑菌效果比較

石洪玥 陸穎 盧正義

摘要：采用牛津杯法比較不同鹽度（0、1%、2%、3%、4%）下五倍子、石榴皮、訶子、黃芩、烏梅5種中草藥對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果，測定了最小抑菌濃度。結果表明，5種中草藥對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌都有不同程度的抑菌效果，其中黃芩和五倍子抑菌作用較強，烏梅抑菌作用較差，而訶子和石榴皮的抑菌作用一般，但石榴皮對嗜水氣單胞菌的抑菌作用較為明顯。不同鹽度下，5種中草藥對這2種致病菌的最小抑菌濃度（MIC）有差異。高鹽度時，5種中草藥對遲緩愛德華氏菌的MIC較低，均≤25 mg/mL，抑菌效果較好;而低鹽度時，各個中草藥MIC均在25 mg/mL及以上，抑菌效果較差。在鹽度為0時，5種中草藥對嗜水氣單胞菌的MIC最低，抑菌效果最好。

關鍵詞：鹽度;中草藥;遲緩愛德華氏菌;嗜水氣單胞菌抑菌;抑菌效果

中圖分類號： S942;S941.42 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0162-04

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）是2種常見的水產動物致病菌，引起水產動物大量死亡，對水產業造成重大威脅[1-5]。目前，對于各種水產動物致病菌的防御多采用抗生素和化學藥物，但抗生素和化學藥物長時間使用具有諸多弊端，如增強致病菌的耐藥性、造成養殖動物體內藥物殘留量日趨增多、使養殖水環境受到污染、引起過敏反應等，這些都導致抗生素和化學藥物的使用受到限制[6-7]。

近年來，越來越多的中草藥被用于防治細菌性傳染病。中草藥作為一種天然藥物，可直接作用于細菌等微生物的結構和代謝而發揮其抗菌作用。研究表明，許多中草藥具有明顯的殺菌抑菌作用，并具有無抗藥性、無殘留及不會引起藥源性疾病等優點[8-10]。開展抗菌中草藥的篩選和應用研究對于動物細菌性疾病的防治具有重要意義[11]。

目前，關于中草藥對水產動物致病菌的抑菌、殺菌研究報道較多[12-17]，但中草藥在不同鹽度下的抑菌、殺菌作用未見報道。鑒于水體鹽度對中草藥的抑菌效果影響較大[6]，因此研究中草藥在不同鹽度下的抑菌效果，更具指導意義。本試驗在現有報道的基礎上[6-9，11-15]，篩選出五倍子（Rhus chinensis）、烏梅（Scutellaria baicalensis）、石榴皮（Terminalia chebula）、黃芩（Prunus mume）和訶子（Punica granatum）5種抑菌、殺菌效果明顯的中草藥，比較它們在不同鹽度下（0、1%、2%、3%、4%）對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果，為上述5種中草藥在不用鹽度養殖水體中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藥品 五倍子、黃芩、訶子、烏梅、石榴皮5種中草藥購自天津市某大藥房，粉碎后保存備用。試驗于5月中旬在天津市水產生態及養殖重點實驗室進行。

1.1.2 培養基 營養瓊脂（北京澳博星生物技術有限責任公司）;Mueller-Hinton培養基（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.3 試驗菌種 遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌均由天津農學院天津市水產生態及養殖重點實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌在超凈工作臺上進行菌種活化。取已滅菌離心管，分別加入 1 mL 生理鹽水備用。再用接種環從盛有源菌的培養基中沾取源菌，將其放入上述盛有生理鹽水的離心管中，充分混勻成菌溶液備用。

分別吸取2種菌溶液各100 μL于營養瓊脂培養基上涂布均勻，置于恒溫培養箱中28 ℃培養24 h，后用生理鹽水沖洗培養基獲得菌液，并放入4 ℃冰箱中保存，紅細胞計數板估算菌液濃度約為2×109 CFU/mL，使用時用生理鹽水稀釋成濃度約為108 CFU/mL的菌懸液。

1.2.2 試驗藥物的制備 使用水提法[18-19]制備試驗藥液。五倍子、黃芩、訶子、烏梅、石榴皮各取50 g于燒杯中，分別加入500 mL蒸餾水，浸泡30 min后煎煮，并用玻璃棒不斷攪動，待煮沸后用文火煮30 min，濾出藥液，繼續加水煎煮，重復3次，合并濾液，旋轉蒸發至250 mL，所得中草藥水提物折合成生藥為200 mg/mL，高壓蒸汽滅菌后于4 ℃冰箱中保存備用，使用前充分振蕩。

1.2.3 不同鹽度下5種中草藥對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果比較 將高鹽度鹵水過濾后加入蒸餾水并高壓滅菌，配制成鹽度分別為0、1%、2%、3%、4%的無菌水，將Mueller-Hinton培養基粉末溶于不同鹽度的無菌水中，倒入玻璃培養皿制備成固體培養基。采用牛津杯法（管碟法）[20]測定5種中草藥在不同鹽度（0、1%、2%、3%、4%）下對2種致病菌的最小抑菌濃度（MIC）。吸取100 μL菌液均勻涂布于固體培養基上，每個培養皿等間距放置3個牛津杯，輕壓使其與培養基緊密接觸。向牛津杯中加200 μL藥液，28 ℃ 培養24 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.4 不同鹽度下5種中草藥對愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度的測定 用二倍稀釋法，將中草藥液稀釋為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL。吸取各濃度中草藥溶液200 μL，加入到不同鹽度培養皿的牛津杯中，作為藥物濃度梯度組。加藥完畢后于恒溫培養箱中28 ℃培養 24 h 后，觀察結果，以牛津杯周圍透亮有抑菌圈表示細菌不生長（-），牛津杯周圍模糊不清無抑菌圈表示有細菌生長（+）。能夠抑制細菌正常生長的最低藥物濃度即為5種中草藥對該種細菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1.3 數據統計與分析

將所得數據用SPSS 19.0做單因素方差分析，差異顯著（P<0.05）的用Duncans法做多重比較，表中數據用“平均 值± 標準誤”表示，n=3。

2 結果與分析

2.1 中草藥對遲緩愛德華氏菌的抑菌圈直徑

由表1可知，鹽度不同時5種中草藥原液對遲緩愛德華氏菌的抑菌圈直徑差異顯著（P<0.05）;而鹽度相同時不同中草藥的抑菌效果同樣差異顯著（P<0.05）。其中，黃芩在各個鹽度條件下對于遲緩愛德華氏菌的抑菌效果都較為明顯，抑菌直徑均>19.00 mm，而五倍子和石榴皮對于遲緩愛德華氏菌的抑菌效果隨鹽度的增加而增強，五倍子、訶子和黃芩在高鹽度條件下抑菌效果顯著高于其他2種藥物（P<0.05），抑菌圈直徑均>29.00 mm。

2.2 中草藥對嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑

由表2可知，不同鹽度下5種中草藥原液對嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑差異顯著（P<0.05）。其中，烏梅對于嗜水氣單胞菌的抑菌效果最差，各個鹽度下的抑菌圈直徑均低于其他中草藥。在鹽度為0時，5種中草藥對于嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑都較其他鹽度條件下抑菌圈直徑大，抑菌圈直徑均 >19.00 mm，黃芩和烏梅這2種中草藥在鹽度1%～3%，抑菌強度隨鹽度增加而增強。

2.3 中草藥水提物對遲緩愛德華氏菌的最小抑菌濃度

由表3可知，5種中草藥水提物在不同鹽度下，藥物濃度越高抑菌效果越好。其中鹽度為4%時，5種中草藥的MIC較低，均≤25 mg/mL，抑菌效果較好;而鹽度為1%和2%時，各中草藥MIC均在25 mg/mL及以上，抑菌效果較差。

2.4 中草藥水提物對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度

由表4可知，5種中草藥水提物在不同鹽度下，藥物濃度越高抑菌效果越好。其中，烏梅和黃芩在高鹽度條件下（鹽度為3%、4%）MIC均≥25 mg/mL，抑菌效果較差，而五倍子、石榴皮和訶子在低鹽度條件下（鹽度為1%、2%）的MIC均≤25 mg/mL，抑菌效果較好，在鹽度為0時，5種中草藥對嗜水氣單胞菌的MIC均≤25 mg/mL，其抑菌效果明顯強于其他鹽度。

3 討論與結論

由本試驗結果可知，在相同鹽度條件下，5種中草藥對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌均有不同程度的抑制作用，其中黃芩和五倍子抑菌作用較強，訶子抑菌作用一般，而烏梅抑菌作用較差。石榴皮對于遲緩愛德華氏菌的抑菌效果一般，但對嗜水氣單胞菌的抑菌效果特別明顯。李權生等用紙片擴散法測定了9種抗生素和10種中草藥對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌等5種常見水產動物致病菌的抑菌效果，研究表明五倍子抑菌效果最好，黃芩次之[21]。其他研究證明，五倍子對于遲緩愛德華氏菌[22]和嗜水氣單胞菌[23-24]均具有比較明顯的抑制作用，本試驗的結果與之基本一致，這可能與五倍子的藥性有關，其富含鞣質，能夠凝固微生物體內的原生質，同時含有多種酶，能夠對多種細菌起抑制作用[25];黃芩的主要成分是黃芩苷，它具有非常廣泛的抗菌譜[26]，如對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌以及沙門氏菌均具有十分良好的抑制作用，還具有很好的抗病毒作用[26]。

遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌均可在鹽度0～4%環境下生長，故設定0、1%、2%、3%、4%共5個鹽度梯度，比較5種中草藥在這5個鹽度梯度下的抑菌效果。鹽度不同時，5種中草藥對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果明顯不同。在高鹽度（鹽度為3%、4%）時，5種中草藥對于遲緩愛德華氏菌的MIC較低，均 ≤25 mg/mL，抑菌效果較好;而在低鹽度（鹽度為1%、2%）時，各個中草藥的MIC均在 25 mg/mL 及以上，抑菌效果較差;在鹽度為0時，5種中草藥對遲緩愛德華氏菌的抑菌作用最弱，而鹽度為4%時抑菌作用最強。由嗜水氣單胞菌的抑菌效果可以看出，嗜水氣單胞菌在鹽度為0時，5種中草藥對其的MIC最低，抑菌效果最好。馬玉和等通過K-B紙片擴散法測得5種中草藥對于遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果，結果是5種中草藥對遲緩愛德華氏菌在鹽度為4%時抑菌效果最強，對嗜水氣單胞菌的抑菌效果在鹽度為0時最好[6]。本試驗的研究結果與之基本一致，這可能與不同鹽度下2種致病菌的活性不同有關。Ring等的研究表明，當北極鮭魚在海水中養殖時，乳桿菌數量下降，而乳酸菌屬細菌和鏈球菌屬細菌的數量保持穩定[27];也有可能是因為中草藥在不同鹽度下的藥性有所變化，關于這一點目前尚未得到論證，還需進一步研究。

五倍子、石榴皮、訶子、黃芩、烏梅對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌均有不同程度的抑菌效果。鹽度影響5種中草藥對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果。高鹽度時，5種中草藥對于遲緩愛德華氏菌MIC較低，抑菌效果較好;而低鹽度時，各個中草藥MIC均在25 mg/mL及以上，抑菌效果較差。

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