德式乳酸桿菌對黃河鯉抗脅迫能力的影響

關素華 曾慶輝 張曉飛

摘要：為研究德式乳酸桿菌對黃河鯉應激前后抗應激指標、血液免疫指標、抗氧化指標和HSP70、HSP90基因表達的影響，選取黃河鯉450尾，隨機分為5組（每組3個平行，每個平行30尾魚），分別投喂在基礎飼料中添加不同濃度乳酸菌（0、1×105、1×106、1×107、1×108 CFU/g）的日糧，養殖8周后，進行擁擠脅迫。試驗結果表明：應激前，皮質醇濃度在1×106、1×107 CFU/g乳酸菌組顯著低于對照組（P<0.05），血糖和乳酸濃度在試驗組顯著低于對照組（P<0.05），溶菌酶活性在1×106、1×107 CFU/g乳酸菌組顯著高于對照組（P<0.05），C3和C4在1×106 CFU/g乳酸菌組顯著高于對照組（P<0.05）。應激后，血液皮質醇、血糖和乳酸濃度都有不同程度的升高，這些指標在添加乳酸菌組的含量均顯著低于對照組（P<0.05），血液溶菌酶活性、C3和C4濃度也有升高趨勢，且在1×106 CFU/g乳酸菌組顯著高于對照組（P<0.05）;應激前后SOD和CAT活性在1×106 CFU/g乳酸菌組顯著高于對照組（P<0.05），MDA含量呈相反的趨勢，在1×106、1×107 CFU/g乳酸菌組顯著低于對照組（P<0.05），應激使HSP70和HSP90基因表達均有升高趨勢，在應激前后試驗組的HSP70和HSP90基因表達量大部分都顯著高于對照組（P<0.05）。該研究結果顯示，飼料中添加1×106～1×107 CFU/g 德式乳酸菌能提高黃河鯉的免疫力、抗氧化和抗應激的能力。

關鍵詞：德式乳酸桿菌;黃河鯉;免疫;應激;抗氧化

中圖分類號： S942.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0166-05

應激是一些有害因子引起動物發生一系列生理防御的總和。在水產養殖中，應激普遍存在，如溶氧量過低、水溫變化、驚嚇、高密度飼養、酸堿度變化、分池、捕撈等都可能造成應激。當魚類受到這些應激后會出現一系列的生理變化，如體內皮質激素的升高，并引起溶菌酶、巨噬細胞和嗜中性粒細胞活力的下降，抑制動物的免疫系統，使其增質量減緩，成活率下降，嚴重影響水產養殖的經濟效益[1]。因此如何防止和減輕應激發生是目前水產養殖研究的一個熱點。

在過去，一旦疾病暴發，多使用抗生素來解決此類問題，但是使用抗生素帶來了很多負面影響，比如病菌抗藥性的增強、抗生素殘留等問題。近年來，使用益生元和益生素來提高水產動物健康水平的報道也日益增多[2-5]，已有報道指出，果寡糖、芽孢桿菌、維生素、大黃素等在水產動物上均有抗應激的效果[6-11]，但是關于乳酸菌抗應激的功效報道較少，因此，本研究通過在飼料中添加不同濃度的乳酸菌，飼喂黃河鯉，研究乳酸菌對黃河鯉免疫、抗氧化和抗應激相關指標的影響，旨在探討乳酸菌在黃河鯉上的作用效果，為防止魚類疾病暴發和應激發生提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 黃河鯉魚，購自河南省洛陽市某養殖場，初始質量為（15±0.3） g，試驗選擇規格一致、健康的鯉魚450尾，隨機分為5組，其中第1組為對照組，對照組投喂基礎飼料，其他4組為試驗組，投喂試驗飼料，每組設3個平行，每個平行30尾魚，共15缸。

1.1.2 試驗飼料 基礎飼料主要用魚粉、豆粕、棉粕、菜粕作為蛋白源，以魚油和豆油作為脂肪源，以次粉作為糖原，配制成蛋白含量為33.6%、脂肪含量為6.62%的基礎飼料（表1），試驗飼料是在基礎飼料中分別添加1×105、1×106、1×107、1×108 CFU/g 德式乳酸桿菌，各種飼料原料充分粉碎后均過60目篩，先把磷酸二氫鈣、食鹽、預混料、膨潤土等混勻，再加入大料并逐級混合，然后在乳酸菌中加入適量的水，與飼料原料混合后用絞肉機制成1.2 mm的顆粒飼料，并在40 ℃下烘 15 h，至飼料水分含量在10%左右，保存在-4 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 飼養管理 養殖試驗于2015年7—9月在河南科技大學水族科學實驗室進行，將黃河鯉馴化2周，馴養期間投喂基礎飼料，試驗開始后，每天投喂3次，分別在08：00、12：00、17：00各投喂1次，日投喂量為魚體質量的3%～5%，并根據攝食情況進行適度的調整，確保飼料在0.5 h內吃完，養殖期間每天測水溫、溶氧量，每2 d換水1次，每次換水1/3以保證水質，整個試驗期間水質記錄如下：水溫為（26±1） ℃，溶解氧含量>5 mg/L，氨氮含量<0.01 mg/L，pH值為6.8～7.5，養殖周期持續8周。

1.2.2 抗應激試驗 養殖試驗結束后，停飼24 h，選取規格基本一致的10尾魚，參照Xie等的方法[12]進行應激試驗，采取高密度（100 g/L）進行擁擠脅迫試驗，每個水平設3個平行，放置于小型玻璃缸中，水溫、溶氧量同“1.2.1”節，應激期間保持安靜，防止額外應激，持續應激6 h后進行采樣。

1.2.3 血液采集與測定

1.2.3.1 血液指標的測定 分別在應激前和應激后對魚進行麻醉，尾靜脈取血，4 ℃、1 500 r/min離心10 min，取血清，于-20 ℃保存，用作應激和血液免疫指標的分析。皮質醇濃度采用放免法進行測定，血糖濃度的測定采用葡萄糖氧化酶法，乳酸濃度的測定采用對羥基聯苯比色法，溶菌酶活性采用比濁法進行測定，補體C3和C4采用酶聯免疫吸附法測定，以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，具體操作見說明書。

1.2.3.2 肝臟抗氧化指標的測定 應激前后快速分離肝臟，于液氮中速凍并保存，稱取一定量的肝臟樣品，用生理鹽水按1 g ∶ 9 mL（肝臟 ∶ 生理鹽水）的比例冰浴勻漿，然后于 4 ℃、3 500 r/min 離心10 min，取上清液用于酶活分析，超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定參照黃嘌呤氧化酶法，過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用紫外法，丙二醛（MDA）含量的測定參照氧化脂質硫代巴比妥酸分光光度計法。

1.2.3.3 基因表達 RNA提?。喝「闻K組織0.1 g左右，參照Trizol使用說明書，提取RNA然后測定其濃度和質量，一般D260 nm/D280 nm在1.8～2.0之間，最后稀釋成相同的濃度進行cDNA反轉錄。

cDNA反轉錄：參照寶生物工程（大連）有限公司提供的試劑盒說明書進行反轉錄。反應程序：第1步42 ℃反應 40 min，第2步90 ℃反應2 min，最后于4 ℃保存。之后10倍稀釋，以備RT-PCR使用。

RT-PCR過程：用Primer 5軟件設計引物，由上海英捷維基生物有限公司合成（表2），按照SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit（TaKaRa公司）使用說明進行RT反應，熒光定量PCR反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55.9 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，45個循環;72 ℃延伸7 min。選用β-actin作為內參基因，用2-ΔΔCT方法計算HSP70和HSP90基因的相對表達量。

1.3 數據統計與分析

試驗數據先用Excel 2007作簡單處理，然后用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，當各組間差異顯著時（P<0.05），用Duncans檢驗法進行均值間的多重比較，結果用平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 德式乳酸菌對鯉魚脅迫應激前后血清皮質醇、血糖和乳酸濃度的影響

由圖1、圖2、圖3可知，應激前血液皮質醇、血糖和乳酸濃度都比較低，皮質醇含量在1×106、1×107 CFU/g乳酸菌處理下顯著低于對照組（P<0.05），其他各組之間差異并不顯著（P>0.05）。血糖和乳酸濃度在試驗組均顯著低于對照組（P<0.05）。應激后，血液皮質醇、血糖和乳酸濃度都有不同程度的升高，這些指標在添加乳酸菌組中的濃度多數均顯著低于對照組（P<0.05）。

2.2 德式乳酸桿菌對黃河鯉應激前后血液免疫指標的影響

由表3可知，應激前血液溶菌酶活性在1×106和1×107 CFU/g 乳酸菌組均顯著高于對照組（P<0.05），1×

108 CFU/g 乳酸菌組和對照組差異并不顯著（P>0.05）;C3和C4含量在1×106 CFU/g乳酸菌組顯著高于對照組（P<0.05），其他各組之間差異不顯著;應激后，血液溶菌酶活性、C3和C4濃度都有不同程度的升高，且1×106 CFU/g乳酸菌組顯著高于對照組（P<0.05），C4含量在1×107 CFU/g乳酸菌組也顯著高于對照組（P<0.05）。

2.3 德式乳酸桿菌對黃河鯉應激前后抗氧化指標的影響

由表4可知，應激前后SOD和CAT活性在1×106 CFU/g乳酸菌組顯著高于對照組（P<0.05），1×105、1×108 CFU/g 乳酸菌組和對照組差異并不顯著（P>0.05）。MDA含量呈相反趨勢，應激前后1×106、1×107 CFU/g乳酸菌組均顯著低于對照組（P<0.05）。

2.4 德式乳酸桿菌對黃河鯉應激前后HSP70和HSP90基因表達的影響

由圖4、圖5可知，應激使HSP70和HSP90基因量表達均有升高趨勢，在應激前后試驗組的HSP70和HSP90基因表達量均顯著高于對照組（P<0.05）。

3 討論

3.1 德式乳酸菌對黃河鯉應激指標的影響

皮質醇是魚體受到應激后通過下丘腦垂體-腎間組織軸（hypothalamus-pituitary-interrenal axis，簡稱HPI）所分泌的一種重要的應激激素[13]。血液皮質醇升高通常作為魚類發生應激的靈敏信號，本研究得出，在應激后皮質醇、血糖和乳酸含量都呈現顯著升高的趨勢，血糖的升高可能是由于隨著皮質醇水平的升高，糖異生的關鍵酶葡萄糖-6-磷酸酶的活性被激活，糖異生和糖原分解作用加強，另外，肌糖原的分解是血液乳酸含量增加的原因之一[14]。相似的研究結果在團頭魴（Megalobrama amblycephala Yih）[15-16]和金頭鯛（Sparus aurata）[17]中都有報道。在飼料中添加適量濃度的乳酸菌，應激前后皮質醇、血糖和乳酸含量都有降低趨勢，這表明乳酸菌可以有效地緩解黃河鯉的擁擠脅迫應激，但是具體的作用機制尚需進一步研究。

3.2 德式乳酸菌對黃河鯉血液免疫指標的影響

溶菌酶是機體內重要的免疫因子之一，主要由巨噬細胞核和嗜中性粒細胞分泌產生，本研究得出，在急性應激后，血液溶菌酶、補體C3和C4都有升高趨勢，這可能是由于在急性應激條件下，魚體通過增加特定溶菌酶和補體含量來增加其免疫活力，共同抵抗由應激帶來的不適反應。有研究報道，一般急性應激會導致溶菌酶活性的升高[18-19]，而長時間的慢性應激會導致其活性的顯著降低，免疫力下降[20]，發生應激后中華鱉（Pelodiscus sinensis）補體C3、C4含量下降[21]，但是添加維生素C能夠促進補體C3和C4的合成，相似的結果在團頭魴[16]中也有報道。應激抑制還可促進補體C3和C4的合成，這與應激強度、應激時間以及應激類型都有很大的關系，但是適量的乳酸菌加強了溶菌酶的活性，也在一定程度上提高了補體C3和C4的水平，這有助于增強魚體的非特異性免疫力。乳酸菌的免疫增強作用在畜禽的研究[22-24]中也有報道，據報道，乳酸菌胞外多糖具有免疫增強的作用[24]。

3.3 德式乳酸桿菌對黃河鯉抗氧化指標的影響

應激能夠引起自由基的大量產生，比如 O-2 · ?和·OH，這些物質會造成機體細胞的脂質過氧化，正常情況下機體的抗氧化系統能夠清除這些自由基，抑制機體過氧化，使機體處于平衡狀態[25]，但是這種平衡狀態會隨著環境條件的改變而被破壞，造成氧化損傷。SOD和CAT作為主要的抗氧化酶，SOD負責把 O-2 · ?轉化成O2和H2O2，CAT能夠把H2O2分解成O2和H2O，以清除機體內過多的自由基[26-27]。本研究得出，SOD和CAT的活性在應激條件下不斷增加，防止機體的氧化損傷。抗氧化物酶活性的升高和機體的氧化應激程度有關，氧化應激程度越高，酶活性也會隨之升高[28]。之前的報道得出，SOD活性在應激條件下（比如鹽度和溫度）都有升高[29]。MDA含量在應激后呈現不斷升高的趨勢，這表明高密度應激會引起黃河鯉脂質過氧化程度的增加，這是因為應激會造成機體的耗氧量增加，容易造成自由基的產生，自由基與多不飽和脂肪酸等抗氧化脂類反應時，會引發脂質過氧化，并最終降解產生MDA。施兆鴻等研究表明，云紋石斑魚（Epinephelus moara）在氨氮脅迫條件下的MDA含量也顯著升高[10]，鹽度脅迫使云紋石斑魚的MDA含量顯著升高，但是添加適量的維生素E可有效減少脂質過氧化物MDA的產生[11]。類似的研究結果在其他魚類和水產類動物中[30-33]都有報道。本試驗結果得出，在擁擠脅迫前后投喂1×106 CFU/g乳酸菌的SOD和CAT活性最高，MDA含量最低。本試驗說明，乳酸菌能夠抑制黃河鯉由應激引起的脂質過氧化程度。乳酸菌的抗氧化功能可能與它的益菌保護作用有關，以前的試驗證明，乳酸菌的代謝產物具有抗氧化功能[34-36]，乳酸菌也可能作為調節腸道微生物平衡的物質促進機體的抗氧化功能。

3.4 德式乳酸桿菌對黃河鯉HSP70和HSP90基因表達的影響

在HSP家族中，HSP70和HSP90參與新生蛋白質合成和損傷蛋白的修復，并參與機體在應激條件下的免疫應答[37]，機體受到外界應激（比如高溫、缺氧和細菌感染等）時，組織中HSP70和HSP90的表達量升高，從而形成保護機制，抵御應激對機體帶來的危害[38-39]。本研究發現，應激后HSP70和HSP90的相對表達量都呈升高趨勢，其表達量升高可能因為當魚類處在應激條件下時，機體為了防止自身的氧化損傷而作出的相應策略。類似的研究在團頭魴的研究中[8]也有報道，Zhang等報道，在高溫和氨氮應激條件下HSPs的表達量均呈升高趨勢[6-7];劉波等研究表明，高溫應激后比應激前羅氏沼蝦HSP70 mRNA的相對表達量顯著升高[9]，相似的研究結果在吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）[40]中也有報道。本研究得出，在飼料中添加一定濃度的乳酸菌應激前后HSP70和HSP90的表達均有升高趨勢，從而增強了對機體的保護作用，HSPs在應激條件下的表達與細胞的分裂、增殖和發育等生理過程都有關系，需要進一步研究。本研究也得出，添加適量的乳酸菌能夠增強HSPs的表達量和機體的抗應激能力，這和免疫指標以及抗氧化功能得出的結果相一致，表明乳酸菌在抗應激和增強免疫方面都起到重要作用。

4 結論

飼料中添加適宜水平的德式乳酸桿菌能夠提高黃河鯉的抗應激能力、免疫力和抗氧化功能，且在本試驗條件下，乳酸菌的最適添加量為1×106～1×107 CFU/g。

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