利用廢紙產纖維素酶復合菌系的篩選及性質研究

曹燕篆 王小娟 袁旭峰

摘要：為了獲得1組能夠高效分解廢紙并產胞外纖維素酶的復合菌系，采用外淘汰法，在常溫條件下以土壤及枯枝落葉為菌源，以廢打印紙為唯一碳源，篩選得到1組復合菌系PSD。結果表明，該復合菌系能夠在6 d內分解紙總質量的71%，其中纖維素降解率為72%，半纖維素降解率為48%。此外，羧甲基纖維素酶活性在分解3 d時達到最高值 3.26 U/mL，半纖維素酶活性在分解4 d時達到最高值6.37 U/mL。當培養溫度在25～35 ℃，培養基pH值在 6.0～8.0，培養基為Hutchinson時，復合菌系具有較好的紙分解效果和產酶活性。利用16S及26S rRNA克隆技術分析微生物組成結果表明，該復合菌系由細菌和真菌組成，其中細菌主要包括厚壁菌門、變形菌門及擬桿菌門，真菌主要包括波氏假性霉樣菌（Pseudallescheria boydii）。由研究結果可知，得到的復合菌系PSD能夠有效分解廢紙并同時分泌纖維素酶，對打印紙廢棄物的分解及資源利用具有一定的應用意義。

關鍵詞：復合菌系;廢紙分解;纖維素酶;微生物組成

中圖分類號： S182;X705 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0237-05

隨著現代制造技術的發展，一次性紙張已經成為廉價商品，過去40年內，全球紙的消費量增長了400%，每年產生的廢紙量達4億t以上。廢紙作為最普遍的回收材料之一，理論上可循環使用6～7次，但是紙經多次回用后纖維流失率大，且纖維短，利用效率低，因此，全球紙張的平均回收水平只有2.4次[1]。不合理處理無法循環利用的廢紙（如填埋或焚燒），會造成溫室氣體的排放、垃圾滲濾液污染等環境問題[2]。因此，開發多種資源化利用方式，對廢紙進行充分利用，不僅可以節約大量植物木質纖維原料，同時可以減少固體廢棄物的排放及對環境的污染。

廢紙主要由纖維素（40%～80%）、半纖維素（5%～15%）及少量的木質素組成[3]。近年來的研究發現，利用多種技術可將廢紙轉化為乙醇、甲烷、氫等能源物質[4-6]，為了提高轉化率，往往需要物理、化學或酶預處理，從而在一定程度上增加了經濟成本，或對環境造成了一定的污染。其中利用酶轉化廢紙材料具有很多優勢，如底物特異性高、能源消費低、環境污染水平低等。然而，昂貴的成本成為纖維素酶制劑應用的瓶頸。近年來，利用農業或者工業廢棄物通過液體或固體發酵的方式生產纖維素酶成為研究熱點，例如以水稻秸稈、玉米穗、象草、甘蔗渣及生活污水等為底物[7-12]。在纖維素酶的相關研究中，由于真菌能夠分泌大量纖維素酶及半纖維素酶，并且會將其分泌到細胞外至培養基中，易于分離純化，成為重要的研究對象。但是，用真菌單獨分解木質纖維素材料往往需要較長時間[13]。近年來的研究發現，復合菌系能夠有效降解水稻秸稈、玉米秸稈、柳枝稷及濾紙等木質纖維素材料，但是以液體微好氧條件培養的復合菌系胞外酶活性較低[14-15]。因此，在好氧條件下篩選1組由真菌及細菌共同組成，且能夠高效分解廢紙并分泌纖維素酶的復合菌系，對廢紙的資源化利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 復合菌系的篩選

復合菌系篩選用Mandels固體培養基，配方如下：1.4 g（NH4）2SO4，2.5 g蛋白胨，0.3 g MgSO4·7H2O，2 g CaCO3，2 g KH2PO4，5 mg FeSO4·7H2O，1.6 mg MnSO4，1.7 mg ZnCl2，1.7 mg CoCl2，12 g瓊脂，1 L去離子水，調節pH值至7.0。將培養基于121 ℃滅菌30 min后倒平板待用。

菌源于2010年取自北京植物園的土壤、枯枝落葉，加入50 mL滅菌去離子水，于200 r/min振蕩20 min，吸取1 mL至上述培養基平板上，將（0.5±0.1） g滅菌的廢打印紙蓋在培養基表面作為唯一碳源，于30 ℃靜置培養。待廢紙分解后，將殘余部分刮下并置于50 mL滅菌離心管中，加入30 mL滅菌去離子水，混勻后吸取0.5 mL進行轉接。淘汰廢紙分解效率低的菌系，將分解能力強的復合菌系每隔4～6 d轉接1次，直至功能穩定。向培養3 d的復合菌系與分解剩余的紙中加入25%甘油，于-80 ℃保存。

1.2 降解率

通過測定紙的總質量減少量及木質纖維素成分質量減少量，分析復合菌系對廢紙的分解能力。將培養3 d的復合菌系通過“1.1”節的方法制備菌液并接種到21個新的培養基上，加入滅菌的廢紙培養6 d，從0 d開始每天取樣，每次3個重復，于60 ℃烘干48 h后稱質量分析紙的分解情況。將殘余的紙烘干后剪至5 mm×5 mm大小，裝入F57專用袋（Model F57，ANKOM Technology，USA）中，根據ANKOM220型纖維分析儀說明書測定纖維素、半纖維素含量。

1.3 粗酶液的制備及酶活性的測定

在培養期間，收集分解殘余的紙制備粗酶液。從平板上刮下分解剩余的紙，加入30 mL滅菌去離子水充分混勻，浸提底物表面的胞外酶，于8 000 r/min離心10 min后所得上清液即為制備好的粗酶液。羧甲基纖維素酶活性及木聚糖酶活性的測定方法參照文獻[16]。

1.4 最佳產酶條件

纖維素酶的產生會受培養基pH值、發酵溫度及養分等的影響[17]，為了確定復合菌系分解廢紙過程中的最佳產酶條件，設置不同培養溫度（25～45 ℃）、培養基pH值（5.0～8.0）及培養基種類（Mandels、Hutchinson、Dubos、PCS及PA）。不同培養基養分組成如下。（1）Hutchinson：1 g/L KH2PO4，0.3 g/L MgSO4·7H2O，0.01 g/L FeCl3，0.1 g/L CaCl2·6H2O，0.1 g/L NaCl，2.5 g/L NaNO3。（2）Dubos：1 g/L K2HPO4，1 g/L NaNO3，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCl，0.05 g/L Fe2（SO4）·H2O。（3）PCS：5 g/L蛋白胨，1 g/L酵母粉，2 g/L CaCO3，5 g/L NaCl。（4）PA培養基：在1 L去離子水中加入200 g馬鈴薯條，煮沸5 min，用紗布過濾后加入去離子水將總體積補足至1 L。上述培養基中均加入12 g/L瓊脂，調節pH值至7.0，于121 ℃滅菌30 min。在上述不同條件下，復合菌系于接種后4 d取樣，測定廢紙的減質量及粗酶液酶活性。

1.5 復合菌系微生物組成分析

復合菌系基因組DNA的提取采用苯酚-三氯甲烷抽提法，將提取后的DNA作為模板進行PCR擴增。DGGE（變性梯度凝膠電泳）及克隆方法參照文獻[15]。測序結果使用Lasergene軟件（DNAStar，Madison，Wisconsin，USA）進行分析，序列相似性比對通過BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/），用MEGA 5.1軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 復合菌系PSD對廢打印紙的分解能力

經過連續傳代30次以上，篩選到1組能夠有效分解廢紙并產纖維素酶的復合菌系PSD。由圖1接種復合菌系后廢紙的總質量降幅及木質纖維素質量降幅可以看出，培養3 d后，紙的總質量減少了24.9%，其中纖維素、半纖維素分別減少了38.1%、29.9%。分解6 d后，復合菌系PSD對廢紙的分解率達到70.6%，其中纖維素減少了71.7%，半纖維素減少了48.2%。從圖1還可以看出，培養3～6 d期間廢紙的分解速率高于培養0～3 d的，并且復合菌系對廢紙中纖維素成分的分解率高于半纖維素。

2.2 酶活性的變化

從圖2可以看出，羧甲基纖維素酶、木聚糖酶活性在接種復合菌系2 d后快速增加，羧甲基纖維素酶活性在接種復合菌系3 d后達到最高值，為3.26 U/mL，木聚糖酶活在接種復合菌系4 d后達到最高值，為6.37 U/mL。結合圖1中復合菌系對廢紙降解率的影響，可見分解2 d后酶活性的快速提高增強了復合菌系對廢紙的分解能力，此外復合菌系PSD能夠有效分解廢紙并以廢紙為底物分泌活性較高的纖維素酶。崔宗均等以堆肥為菌源，篩選到1組能夠高效分解天然木質纖維素的復合菌系MC1，但是其胞外酶活性很低[18]。另外，復合菌系XDC-2雖然能夠分泌高活性的胞外木聚糖酶，但胞外羧甲基纖維素酶活性卻很低，只有0.108 U/mL[19]。Richa等從土壤中分離出一些能夠有效分解紙的真菌，但有關紙的分解情況及產酶情況并沒有相關報道[20]。

2.3 產酶條件的優化

在不同培養條件下，接種復合菌系PSD 4 d后紙的分解率及產酶活性見圖3。可以看出，當培養溫度為25～35 ℃時，廢紙的分解率及粗酶液的酶活性都較高，其中30 ℃時的分解率最高，為36.1%，在25 ℃條件下，復合菌系產酶的酶活性最高。但是當溫度≥40 ℃時，廢紙的分解率及酶活性明顯下降。由此可見，復合菌系在溫度≤35 ℃時能有效降解廢紙并產纖維素酶（圖3-A）。當培養基pH值為6.0時，羧甲基纖維素酶活性、半纖維素酶活性都達到最高值。將其最高相對酶活性視為100%，當培養基pH值高于6.0時，羧甲基纖維素酶、半纖維素酶的相對酶活性分別高于73%、86%，廢紙的總分解率大于45%，并且當培養基pH值為7.0時，分解率最高，為51.1%。但是當pH值小于6.0時，無論是廢紙的降解率，還是復合菌系產纖維素酶的酶活性都明顯降低。總體看出，pH值為6～8時，復合菌系有較好的紙分解效果和產酶活性（圖3-B）。以Hutchinson為培養基廢紙為唯一碳源時，復合菌系對廢紙的降解率最高，為50.1%，并且羧甲基纖維素的酶活性最高。當培養基為Hutchinson、Mandels及Dubos時，廢紙的降解率及酶活性明顯高于PCS、PA培養基的降解率與酶活性（圖3-C）。由此可見，Hutchinson為復合菌系分解及產酶的最佳培養基。

2.4 復合菌系PSD的微生物組成穩定性

為了確定復合菌系PSD的微生物組成已經穩定，利用PCR-DGGE技術對其總DNA進行分析。保存復合菌系繼代培養過程中4 d后的培養物（第30、33、36、39代），提取總DNA并利用引物對357F-GC、517R及NL1-GC、LS2分別進行PCR擴增后用于DGGE分析。細菌、真菌的DGGE圖譜見圖4，可見繼代培養過程中不同代真菌、細菌的群落結構相同，說明經過長期馴化培養，復合菌系PSD的菌群結構穩定，復合菌系在分解木質纖維素過程中群落結構的穩定性能夠保證其功能的穩定性。

2.5 復合菌系PSD的微生物組成

利用克隆技術，分析復合菌系PSD的微生物組成，其16S rDNA、26S rDNA系統發育樹分別見圖5、圖6。本研究共獲得200個細菌克隆子，測序分析結果表明，主要為厚壁菌門（31.1%）、變形菌門（24.1%）及擬桿菌門（44.6%），其中厚壁菌門主要包括Sedimentibacter、柯恩氏菌（Cohnella）及泰氏菌屬（Tissierella）。克隆子B74與Sedimentibacter sp. enrichment culture clone MB2_218有96%的相似性，有報道稱，該菌對1，2，4-三氯二苯并-對-二英具有還原脫氯的作用[21]。克隆子B102、B160與Cohnella sp. FCN3-3（HQ704069）具有98%的相似性，該菌是1株從牛糞中分離并具有纖維素分解能力的細菌[22]。變形菌門主要包括假單胞菌（Pseudomonas）、不粘柄菌屬（Asticcacaulis）及紅桿菌屬（Rhodobacter），其中克隆子B35與Pseudomonas stutzeris（施氏假單胞菌） train S1（AY485995）具有99%的相似性，該菌是從土壤中分離得到的，具有降解氟氯氰菊酯的能力[23]。擬桿菌門主要包括哈氏噬纖維菌（Cytophaga hutchinsonii）、Cf. Cytophaga、Dysgonomonas及Chitinophaga。其中克隆子B31與Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406（CP000383）具有91%的相似性，對該菌的基因組測序發現能夠編碼很多參與纖維素利用的基因[24]。另外，在復合菌系XDC-2的微生物組成中也檢測到Pseudomonas stutzeri、Dysgonomonas的存在[19]。Wang等篩選到的1組能夠高效降解木質素、芳香族化合物的復合菌系LDC中有Pseudomonas sp.、Cohnella的存在[25]。

對獲得的180個真菌克隆子進行測序的結果表明，共有波氏假性霉樣菌（Pseudallescheria boydii）、Filobasidium floriformes及輪枝菌（Verticillium sp.）3種真菌，其中80.7%的序列與Pseudallescheria boydii（AB363764）具有99%的相似性。據報道，該菌廣泛存在于堆肥中，可有效降解有機物，同時還可利用碳氫化合物及揮發性烷烴類物質，如乙烷、丙烷、丁烷等[26-27]。另外，研究發現Pseudallescheria boydii可有效降解有毒物質2，3，7，8-四氯二苯并二英及多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs）[28-29]。12.5%的序列與Verticillium sp.（AY312607）具有99%的相似性，有研究發現，黑白輪枝菌（Verticillium alboatrum）、黃萎病病菌（Verticillium dahliae）都能夠分泌多種纖維素酶并能有效分解纖維素。Klosterman等對這2株真菌進行宏基因組測序，結果發現基因組中有很多編碼果膠降解酶及碳水化合物活性酶的基因[30-31]。據筆者所知，本研究是第1次在復合菌系中檢測到有Verticillium sp.的組成。因此可見，PSD是一組由細菌和真菌共同組成的復合菌系。

3 結論

本研究成功篩選到1組能夠高效降解廢紙，同時分泌胞外纖維素酶的復合菌系PSD。該復合菌系能夠在6 d內分解紙總質量的71%，其中纖維素、半纖維素的降解率分別為72%、48%。在復合菌系分解廢紙期間，胞外羧甲基纖維素酶活性在3 d時達到最高值，為3.26 U/mL，半纖維素酶活性在 4 d 時達到最高值，為6.37 U/mL。

16S rDNA、26S rDNA克隆文庫結果表明，復合菌系由真菌、細菌組成，其中細菌Cohnella、Pseudomonas及Cytophaga hutchinsonii可能是功能菌，Pseudallescheria boydii是主要的真菌組成。

參考文獻：

[1]Zhang Z，Macquarrie D J，de Bruyn M，et al. Low-temperature microwave-assisted pyrolysis of waste office paper and the application of bio-oil as an Al adhesive[J]. Green Chemistry，2015，17（1）：260-270.

[2]Rahman M O，Hussain A，Basri H. A critical review on waste paper sorting techniques[J]. International Journal of Environmental Science and Technology，2014，11（2）：551-564.

[3]Ioelovich M. Waste paper as promising feedstock for production of biofuel[J]. Journal of Scientific Research and Reports，2014，3（7）：905-916.

[4]Nishimura H，Tan L，Sun Z Y，et al. Efficient production of ethanol from waste paper and the biochemical methane potential of stillage eluted from ethanol fermentation[J]. Waste Management，2016，48：644-651.

[5]Baba Y S，Tada C，Fukuda Y，et al. Improvement of methane production from waste paper by pretreatment with rumen fluid[J]. Bioresource Technology，2013，128：94-99.

[6]Pendyala B，Chaganti S R，Lalman J A，et al. Using a food and paper-cardboard waste blend as a novel feedstock for hydrogen production：influence of key process parameters on microbial diversity[J]. International Journal of Hydrogen Energy，2013，38（15）：6357-6367.

[7]Zheng W，Zheng Q，Xue Y，et al. Influence of rice straw polyphenols on cellulase production by Trichoderma reesei[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2017，123（6）：731-738.

[8]Xia L M，Shen X L. High-yield cellulase production by Trichoderma reesei ZU-02 on corn cob residue[J]. Bioresource Technology，2004，91（3）：259-262.

[9]Visser E M，Falkoski D L，de Almeida M N，et al. Production and application of an enzyme blend from Chrysoporthe cubensis and Penicillium pinophilum with potential for hydrolysis of sugarcane bagasse[J]. Bioresource Technology，2013，144（6）：587-594.

[10]Lan T Q，Wei D，Yang S T，et al. Enhanced cellulase production by Trichoderma viride in a rotating fibrous bed bioreactor[J]. Bioresource Technology，2013，133（4）：175-182.

[11]Libardi N，Soccol C R，Góes-Neto A，et al. Domestic wastewater as substrate for cellulase production by Trichoderma harzianum[J]. Process Biochemistry，2017，57：190-199.

[12]Azadian F，Badoei-Dalfard A，Namaki-Shoushtari A，et al. Production and characterization of an acido-thermophilic，organic solvent stable cellulase from Bacillus sonorensis HSC7 by conversion of lignocellulosic wastes[J]. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology，2017，15（1）：187-196.

[13]Dong X Q，Yang J S，Zhu N，et al. Sugarcane bagasse degradation and characterization of three white-rot fungi[J]. Bioresource Technology，2013，131（2）：443-451.

[14]崔宗均，李美丹，樸 哲，等. 一組高效穩定纖維素分解菌復合系MC1的篩選及功能[J]. 環境科學，2002，23（3）：36-39.

[15]Yang H，Wu H，Wang X，et al. Selection and characteristics of a switchgrass-colonizing microbial community to produce extracellular cellulases and xylanases[J]. Bioresource Technology，2011，102（3）：3546-3550.

[16]溫博婷，袁旭峰，華彬彬，等. 纖維素分解菌系WSD-5常溫產酶高溫糖化小麥秸稈研究[J]. 中國農業大學學報，2014，19（2）：36-42.

[17]Kuhad R C，Deswal D，Sharma S A，et al. Revisiting cellulase production and redefining current strategies based on major challenges[J]. Renewable & Sustainable Energy Reviews，2016，55：249-272.

[18]崔宗均，樸 哲，王偉東，等. 一組高效穩定纖維素分解菌復合系MC1的產酶條件[J]. 農業環境科學學報，2004，23（2）：296-299.

[19]Guo P，Zhu W B，Wang H，et al. Functional characteristics and diversity of a novel lignocelluloses degrading composite microbial system with high xylanase activity[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，20（2）：254-264.

[20]Richa S，Subhash C，Amrita S. Isolation of microorganism from soil contaminated with degraded paper in Jharna village[J]. Journal of Soil Science，2013，4（2）：23-27.

[21]Bunge M，Wagner A，Fischer M，et al. Enrichment of a dioxin-dehalogenating Dehalococcoides species in two-liquid phase cultures[J]. Environmental Microbiology，2008，10（10）：2670-2683.

[22]Khianngam S，Tanasupawat S，Akaracharanya A，et al. Cohnella cellulosilytica sp. nov.，isolated from buffalo faeces[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2012，62（8）：1921-1925.

[23]Saikia N，Das S K，Patel B K，et al. Biodegradation of beta-cyfluthrin by Pseudomonas stutzeri strain S1[J]. Biodegradation，2005，16（6）：581-589.

[24]Xie G，Bruce D C，Challacombe J F，et al. Genome sequence of the cellulolytic gliding bacterium Cytophaga hutchinsonii[J]. Applied and Environmental Microbiology，2007，73（11）：3536-3546.

[25]Wang Y X，Liu Q，Yan L，et al. A novel lignin degradation bacterial consortium for efficient pulping[J]. Bioresource Technology，2013，139（7）：113-119.

[26]April T M，Abbott S P，Foght J M，et al. Degradation of hydrocarbons in crude oil by the ascomycete Pseudallescheria boydii （Microascaceae）[J]. Canadian Journal of Microbiology，1998，44（3）：270-278.

[27]Anastasi A，Varese G C，Marchisio V F. Isolation and identification of fungal communities in compost and vermicompost[J]. Mycologia，2005，97（1）：33-44.

[28]Ishii K，Furuichi T，Tanikawa N，et al. Estimation of the biodegradation rate of 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin by using dioxin-degrading fungus，Pseudallescheria boydii[J]. Journal of Hazardous Materials，2009，162（1）：328-332.

[29]Aranda E，Godoy P，Reina R A，et al. Isolation of of ascomycota fungi with capability to transform PAHs：insights into the biodegradation mechanisms of penicillium oxalicum[J]. International Biodeterioration & Biodegradation，2017，122：141-150.

[30]Klosterman S J，Subbarao K V，Kang S，et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens[J]. PLoS Pathogens，2011，7：e1002137.

[31]Talboys P W. Degradation of cellulose by Verticillium albo-atrum[J]. Transactions of the British Mycological Society，1958，41（2）：242-248.劉宏舉，姚樹然，董航宇. 近57年來河北省冬小麥干熱風時空分布及突變檢驗[J]. 江蘇農業科學，2019，47（1）：242-246.