絮凝菌WSZ03的廉價培養及其處理糖蜜乙醇廢液的研究

李夢茜 曹忠旺 張仁文

摘要：從制糖廠廢液污泥中分離篩選得到具有高絮凝活性的絮凝菌株WSZ03，采用分子生物學結合形態學特征對WSZ03菌株進行鑒定，通過內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，簡稱ITS）序列分析結合形態學觀察確定WSZ03屬曲霉屬。探討利用糖蜜乙醇廢液對其進行廉價培養及同時處理糖蜜乙醇廢液的可行性。結果表明，該菌株培養48 h的菌液適合作為絮凝菌種;WSZ03絮凝菌對糖蜜乙醇廢水的最佳絮凝條件如下：接種量2%、培養時間36 h、溫度28～34 ℃，pH值6。糖蜜乙醇廢水的化學需氧量（chemical oxygen demand，簡稱COD）去除率達到75.00%，色度去除率為62.50%，濁度去除率為88.89%。

關鍵詞：絮凝菌;糖蜜乙醇廢液;廉價培養;絮凝條件

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0261-03

收稿日期：2017-09-12

基金項目：廣西高校中青年教師基礎能力提升項目（編號：KY2016LX286）;河池學院校級重點科研課題（編號：XJ2016ZD001）;河池學院校級大學生創新創業計劃（編號：SJ2016042）;廣西壯族自治區級大學生創新創業計劃（編號：201710605096）。

作者簡介：李夢茜（1986—），女，河南周口人，碩士，講師，主要從事微生物天然產物方向的研究。E-mail：limengxi66@126.com。

通信作者：張振旺，博士研究生，主要從事分子生物學方向的研究。E-mail：zhenwangzhang@126.com。 糖蜜乙醇廢水是以糖廠制糖副產品糖蜜為原料，在發酵生產乙醇過程中產生的高濃度有機廢水，含有大量碳水化合物、脂肪、蛋白質、纖維素等有機物，如果直接排放，會造成水體富營養化，其結果是水體黑臭，甚至失去功能，從而嚴重影響環境[1-2]。目前，該類廢水的常規處理方法為生化處理法、化學處理法或多種方法的組合工藝等[3]。微生物絮凝劑（MBF）是利用生物技術，從微生物體或其分泌物中提取純化而獲得的一種天然高分子絮凝劑，該類絮凝劑可使液體中不易降解的固體懸浮顆粒發生凝聚沉降，是具有生物分解性和安全性的高效、無毒、無二次污染的綠色水處理劑。近年來，有不少學者報道了微生物絮凝劑在污水處理中的應用[4-10]，但是由于MBF制備成本高，產量低，生產菌種篩選困難，導致目前微生物絮凝劑多處于實驗室研究階段，在工業上并未得到廣泛推廣。因此，尋找廉價、高效的微生物絮凝劑生產方法，能有效地推動其廣泛應用。

針對上述問題，本研究以糖蜜乙醇廢水為培養基主要成分，從糖廠廢液污泥中篩選對糖蜜乙醇廢水具有絮凝活性的絮凝菌，通過比較廢水處理前后的化學需氧量（chemical oxygen demand，簡稱COD）、濁度、色度的變化，對絮凝菌的最佳絮凝條件進行優化，以得到對糖蜜乙醇廢水較理想的處理效果。

1 材料與方法

1.1 菌種來源與培養基

菌種：從宜州博慶公司懷遠糖廠的廢水污泥中篩選得到。固體培養基：10倍液糖蜜乙醇廢液1 000 mL，瓊脂粉20 g，調節pH值為7.0。液體培養基：10倍液糖蜜乙醇廢水，調節pH值為7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種分離與篩選 采用稀釋涂布法將污泥進行梯度稀釋，并涂布在滅菌的平皿培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養3～5 d，用劃線法純化得到單一菌落，將純菌落接種于裝有50 mL液體培養基的250 mL搖瓶中，于28 ℃、80 r/min搖床中振蕩培養48 h得到菌株發酵液，測定菌株發酵液和初始液體培養基的吸光度，進行絮凝活性的初步分析。

1.2.2 絮凝率的測定 吸取靜置20 min的菌株發酵上清液，采用二極管陣列分光光度計，在550 nm處測定吸光度（以D550 nm（B）表示），取稀釋10倍的糖蜜乙醇廢液，以550 nm處的吸光度（以D550 nm（A）表示）為對照，計算絮凝菌的絮凝率：

絮凝率=（D550 nm（A）-D550 nm（B））/D550 nm（A）×100%。

1.2.3 菌種鑒定 采用平板劃線法獲得單菌落，觀察菌落生長形態，并借助顯微鏡觀察菌絲和孢子形態，以初步鑒定菌屬，同時結合基因序列的測定確定菌屬，其中基因序列的測定先使用生工生物工程（上海）股份有限公司的DNA提取試劑盒提取目標菌株的基因組DNA，以ITS1+ITS4作為擴增真菌內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，簡稱ITS）的通用引物，交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，再將所得測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）網站進行BLAST比對分析。

1.2.4 絮凝條件的優化

1.2.4.1 單因素試驗 考察接種量、培養時間、培養溫度和初始pH值等4個因素對WSZ03絮凝效果的影響。

（1）接種量。將于28 ℃、80 r/min搖床中振蕩培養48 h得到的菌液作為種子液（菌體濃度104 CFU/mL），接入糖蜜乙醇廢液裝液量為50 mL的250 mL三角瓶中，接種量分別為1%、2%、4%、6%、8%、10%，在搖床中振蕩培養，得到菌株發酵液，測定菌株發酵液、發酵培養基的吸光度，計算絮凝率。

（2）培養時間。在250 mL三角瓶中加入50 mL糖蜜乙醇廢水，再接入種子液，接著于28 ℃、80 r/min搖床中分別培養6、12、18、24、30、36、42、48 h，得到菌株發酵液，測定菌株發酵液、發酵培養基的吸光度，計算絮凝率。

（3）培養溫度：在250 mL三角瓶中加入50 mL糖蜜乙醇廢水，接入種子液，接著分別在22、25、28、31、34、37 ℃下 80 r/min 搖床中振蕩培養，得到菌株發酵液，測定菌株發酵液和發酵培養基的吸光度，計算絮凝率。

（4）初始pH值：在250 mL三角瓶中加入50 mL糖蜜乙醇廢水，利用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH分別調節pH值為3、4、5、6、7、8、9、10后接入種子液，接著在28 ℃、80 r/min搖床中振蕩培養，得到菌株發酵液，測定菌株發酵液、發酵培養基的吸光度，計算絮凝率。

1.2.4.2 正交試驗 設計接種量、絮凝時間、溫度、初始pH值等4個因素的3個水平，考察影響絮凝率的條件，以得出絮凝菌的最佳絮凝條件，因素水平設計見表1。

1.2.5 處理糖蜜乙醇廢水 在最佳絮凝條件下，用絮凝菌對糖蜜乙醇廢水進行處理，比較處理前后水質的參數變化，衡量水質參數的指標為COD、色度和濁度。

采用COD測定計（型號：A-7325）測量COD，采用濁度儀 （型號：BTCJ-TSS）測量濁度，利用色度計（HI93727色度比色計）測定色度。

2 結果與分析

2.1 絮凝劑產生菌的選擇

從宜州博慶公司懷遠糖廠的廢水污泥中經初篩、復篩分離純化得到1株具有高絮凝活性的菌株，其絮凝率為92%，因此選擇該菌株用于后續試驗。

2.2 絮凝劑產生菌的鑒定

菌種形態學觀察及ITS序列的測序鑒定：在固體培養基上于28 ℃培養2 d，可見白色菌絲，3 d開始產生孢子，5 d時孢子成熟。菌落直徑約為3 cm，正面干燥蓬松，呈灰棕色（圖1-a）;孢子呈圓形、灰色（圖1-b）。結合ITS測序結果（ITS片段長度為760 bp，圖2），初步判斷WSZ03菌株屬于曲霉屬。

2.3 SWZ03的絮凝率曲線

于稀釋10倍的糖蜜乙醇廢液培養基中接入1%絮凝菌孢子懸液，不同培養時間段對糖蜜乙醇廢液的絮凝效果見圖3。可以得出，該菌培養在48 h時達到較高的絮凝活性，通過測定菌體濕質量可知，此時菌體的生物量也已經達到最高水平。因此，后續試驗均采用培養48 h的菌液作為菌種。

2.4 接種量對WSZ03絮凝效果的影響

采用“1.2.4.1”節中的試驗方法，考察接種量、培養時間、培養溫度和初始pH值等4個因素對絮凝菌絮凝效果的影響。由圖4至圖7的單因素絮凝試驗結果表明，接種量對絮凝活性的影響不大，當接種量為2%時，絮凝效果明顯;當培養時間為36 h時，絮凝率較高;培養溫度對絮凝活性的影響亦不明顯，31 ℃時的絮凝率較高;當初始pH值為6時，絮凝率較高。

2.5 絮凝條件的正交試驗

按照“1.2.4.2”節的試驗方法對以上影響絮凝效果的4個因素做4因素3水平正交試驗。由表2可知，4個因素極差從小到大的順序為時間<溫度<接種量見，4個因素對WSZ03菌株絮凝效果的影響程度排序為pH值>接種量>溫度>時間。結合單因素試驗結果，綜合分析得出絮凝菌的最優絮凝條件如下：接種量為2%，絮凝時間為36 h，溫度為 28～34 ℃，pH值為6。

2.6 糖蜜乙醇廢水的處理

利用“2.5”節中確定的最優絮凝條件，測定懷遠糖廠糖蜜乙醇廢水經WSZ03絮凝處理后的COD、濁度和色度去除率。由圖8可知，糖蜜乙醇廢水的COD去除率達到75.00%，色度去除率為62.50%，濁度去除率為88.89%。菌株WSZ03對糖廠糖蜜乙醇廢液有較好的處理效果，尤其對濁度的清除效果比較明顯。

3 結論與討論

本研究利用糖蜜乙醇廢液對微生物絮凝菌進行廉價培養，同時考察處理糖蜜乙醇廢液的可行性。本試驗的優勢在于降低了微生物絮凝劑的培養成本。結果表明，本研究篩選出的WSZ03菌株對糖廠糖蜜乙醇廢水有明顯的絮凝效果。菌株WSZ03對糖蜜乙醇廢水的最佳絮凝條件如下：接種量為2%，時間為36 h，溫度為28～34 ℃。菌株WSZ03所產絮凝活性物質對糖蜜乙醇廢水COD的去除率為75.00%，色度去除率為62.50%，濁度去除率為88.89%。筆者所在團隊利用WSZ03菌株處理其他種類廢水，如重金屬廢水、煤泥廢水等發現，WSZ03菌株絮凝劑有寬泛的適用范圍，具有一定的實際應用前景。糖蜜乙醇廢液含有大量難降解的有機物，并且色度高，通過單一絮凝菌株處理很難實現達標排放，因此在實際應用中，需要考慮采用混合菌種產生的復合絮凝劑以增強糖蜜乙醇污水的處理效果，或者與其他處理技術聯合使用，進行污水處理研究。

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