虎杖苷轉化菌的篩選及所產酶的性質研究

張玉千 周學 鄭丹

摘要：利用專一性底物法，以虎杖水提液為初始培養基，經過初篩復篩獲得轉化菌。根據菌落形態特征對菌株進行初步鑒定，對轉化菌產酶的酶學性質進行研究。結果表明，通過篩選得到1株特異性轉化虎杖苷為白藜蘆醇的菌株，經形態學鑒定為青霉菌。該菌產的酶最適pH值為5.0，最適溫度為60 ℃;Fe2+、Na+和Ca2+對酶活力有激活作用;虎杖苷是該酶理想的水解作用底物。利用該菌產的酶液轉化虎杖原料，虎杖苷的轉化率最高可達到100%。

關鍵詞：白藜蘆醇;青霉菌;微生物轉化;虎杖苷

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0264-04

虎杖是一種常用的中藥原料，主要活性成分是虎杖苷（白藜蘆醇苷）、白藜蘆醇和蒽醌類化合物。其中，白藜蘆醇活性較高，具有抗炎殺菌、抗氧化、抗腫瘤、保肝護肝、保護心血管及免疫調節等活性[1-8]。白藜蘆醇的制備方法有傳統提取法、微生物轉化法、微生物發酵法。傳統提取法主要以蓼科、葡萄科、豆科植物為原料提取[9-10]。其中，蓼科植物虎杖中白藜蘆醇的含量可達0.45%，虎杖苷的含量最高可達2.55%[11]。虎杖苷是白藜蘆醇與β-D-葡萄糖結合形成的糖苷，水解該糖苷鍵可以將虎杖苷轉化成白藜蘆醇[12]。如果能將白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇，理論上可使其含量提高3.3倍[13]，可以大大增加虎杖的藥用價值。

針對虎杖苷中β-D-葡萄糖苷鍵的水解方法有化學法和生物法?；瘜W降解法工序復雜，成本高，分離純化困難，且白藜蘆醇光熱穩定性差[14]，所以對虎杖苷的化學降解方法研究得較少。生物轉化法中，王輝以篩選出高活性β-葡萄糖苷酶為依據篩選出米曲霉，利用該菌搖瓶發酵46 h后，虎杖苷可以被完全轉化為白藜蘆醇[15]。田天麗篩選得到根霉 T-34，通過帶渣固體發酵技術在最佳發酵條件下發酵24 h后虎杖苷的轉化率可達98%[13]。馮薇等篩選出細菌轉化虎杖苷，8 h轉化率可達90%以上。微生物轉化虎杖的本質是通過所產生的β-葡萄糖苷酶水解虎杖苷，利用商品酶或利用微生物制備的酶制劑可用于虎杖苷的轉化。王輝利用米曲霉所產的β-葡萄糖苷酶粗酶液直接處理虎杖粗藥材，12 h轉化率達100%[15]。

陳蓉蓉等對多種商品酶進行了篩選，確定以β-葡萄糖苷酶的轉化效果最好，轉化率高達98%[16]。生物酶的轉化工藝較穩定，做成固定化酶可重復利用，轉化效率高，但酶的純化較為困難，商品酶成本高，在工業中的應用受到限制。利用微生物產酶轉化虎杖苷較為可行，而篩選出轉化時間短、轉化效率高的菌種尤為重要。本試驗篩選得到1株轉化菌，對轉化菌所產的β-葡萄糖苷酶的酶學性質進行研究，并且用粗酶液直接轉化虎杖原料粉末。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：青霉菌。

初篩培養基（%）：10%虎杖煮提液，MgSO4 0.05 g，NaNO3 0.5 g，FeSO4 0.001 g，KH2PO4 0.1 g，瓊脂1.8 g，pH值自然。

復篩培養基：10%虎杖煮提液，pH值自然。

固體產酶培養基：麩皮、豆粕粉（碳氮比為6 ∶ 4）。

固體營養液：磷酸氫二鈉1 g，硫酸銨2 g，硫酸鎂0.1 g，加水定容至100 mL，固液比為1 ∶ 2。

材料：虎杖藥材產自江蘇省寶華山。白藜蘆醇苷、白藜蘆醇對照品的純度為98%，購自西安華翠生物技術有限公司。甲醇（HPLC級）、乙醇、乙睛（HPLC級）、乙酸乙酯。

儀器：GNP-9080隔水式恒溫培養箱（上海精宏實驗設備公司）;ES-315高壓蒸汽滅菌鍋（TOMY，Japan）;Agilent 1260高效液相色譜儀（Agilent公司）;HD-930型組合式全溫搖床（江蘇太倉市博萊特實驗儀器廠）;高速離心機Sigma 3k30（Sigma公司）。

1.2 菌種篩選與鑒定

1.2.1 虎杖苷轉化菌的篩選 初篩：取虎杖粉末用無菌水沖洗，梯度稀釋，按常規方法涂布，30 ℃培養2 d，挑選出長勢良好的單菌落，保藏待用。復篩：將初篩菌種活化培養，制成孢子懸液，轉接至復篩培養基，30 ℃、160 rpm培養，取樣檢測。

1.2.2 菌種鑒定 將篩選到的菌株接種到PDA培養基上，在不同時間觀察菌落生長性狀，待產孢后取菌絲制作臨時玻片在透視顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子梗、分生孢子，并描述它們的形態特征;用透視顯微鏡觀察菌絲的自然生長和分支狀況。根據形態特征對菌株進行分類鑒定。

1.3 酶學性質研究

1.3.1 粗酶液的制備 將活化后的菌種斜面用無菌水制成孢子懸浮液，接種到發酵產酶培養基，28 ℃條件下靜止培養48 h。取固體曲，用pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液浸提，固液比為1 ∶ 10，將其用尼龍紗布過濾，4 500 rpm離心15 min，上清液即為酶液。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶最適溫度及穩定性 在不同溫度下分別以1%水楊苷和0.05%虎杖苷為底物，按常規法測定酶活力，分別于50、55、60、65、70 ℃測定酶活力。酶液分別在30、40、50、60、70 ℃下保溫12 h，測定酶活力。取酶液，放于 60 ℃ 水浴中，分別在2、4、6、8、10、12 h取樣，檢測酶活力。

1.3.3 pH值對β-葡萄糖苷酶活性及酶的酸堿穩定性的影響 分別配制pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氫二 鈉- 檸檬酸緩沖液，常規方法測定酶活力。此外，將酶液與上述不同pH值緩沖液在60 ℃下放置1 h后，按常規法測定對應的酶活力。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶的底物特異性 分別配制濃度為 0.5% 的甜菊苷、虎杖苷、水楊苷、纖維二糖、京尼平苷溶液，再以它們為底物，按常規法測定對應的酶活力。

1.3.5 不同金屬離子對β-葡萄糖苷酶活力的影響 選取氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鈷為試劑，在酶反應液中分別加入上述金屬離子，使其終濃度為1.0 mmol/L，于60 ℃溫30 min，按常規法測定酶活力，以不加金屬離子的酶活力為100%。

1.4 β-葡萄糖苷酶酶活力測定方法

水楊苷法測定β-葡萄糖苷酶活力：于0.2 mL水楊苷溶液中加入0.2 mL酶液，混勻后60 ℃反應10 min，加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑后沸水浴5 min，冷卻后蒸餾水定容至10 mL，在540 nm下測定其吸光度。

酶活力單位定義：1 mL酶液在pH值5.0、60 ℃下催化反應1 min，產生1 μg葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位。

2 結果與分析

2.1 虎杖苷轉化菌的篩選

通過初篩得到11株長勢較好的菌種，菌株編號及轉化27 h虎杖苷轉化率如圖1所示。初篩獲得的11株菌種中，僅有H4、H6和2-6號菌有轉化效果，且在轉化27 h后轉化率都達到了最大。其中H6號菌的轉化率最高，為98%，故選取H6號菌作為虎杖苷轉化菌株。

2.2 轉化菌的鑒定

通過觀察，菌落為綠色，背面為黃色。顯微鏡下觀察并記錄菌種的顯微形態。由圖2可知，顯微鏡下菌絲無色透明，表面光滑，有隔膜，直徑為4～5 μm，菌絲上產生簡單的長而直立的分生孢子梗，分生孢子梗分枝呈掃帚狀。孢子梗上著生分生孢子鏈，分生孢子為橢圓形，兩端稍細，長5～7 μm，寬 3～4 μm。根據以上菌落形態、菌絲形狀、孢子的形狀及大小，初步確定為青霉屬。

2.3 酶學性質研究

2.3.1 β-葡萄糖苷酶最適溫度 由圖3-a和圖3-b可知，隨著反應溫度的增加，酶活力先提高后降低，在60 ℃時酶活力最高。以水楊苷為底物和以虎杖苷為底物測得的酶活力變化趨勢一致。以水楊苷為底物測定酶活力能準確地反映該酶對底物的轉化能力。

2.3.2 酶的穩定性影響 酶液分別在30、40、50、60、70 ℃下保溫12 h，按常規法測定對應的酶活力。取酶液，放于60 ℃水浴中保藏，分別在2、4、6、8、10、12 h取樣，常規方法檢測酶活力。由圖4可知，β-葡萄糖苷酶在50 ℃以下保溫12 h后基本不失活，在60 ℃保溫12 h后酶活力有損失，60 ℃以后酶活力損失較大。由圖5可知，60 ℃下，1～10 h內酶活力較穩定，10 h后酶活力降幅較大。

2.3.3 pH值對β-葡萄糖苷酶活性及酶的酸堿穩定性的影響 分別配制pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氫二 鈉- 檸檬酸緩沖液，采用常規方法測定酶活力。此外，將酶液與上述不同pH值緩沖液在60 ℃下放置1 h后，按常規法測定其對應的酶活力。由圖6可知，β-葡萄糖苷酶活力隨著pH值的上升先提高后降低，在pH值為5.0時酶活力最高，這與多數文獻報道的一致。由圖7可知，酶在pH值為4.0～6.0之間時，相對酶活力較高，保持了較高的穩定性，在pH值>6.0或pH值<4.0時，酶活力明顯下降。

2.3.4 β-葡萄糖苷酶的底物特異性 在標準條件下，用 0.5% 的不同底物與酶液反應，結果如表1所示。由表1可知，酶對虎杖苷的水解效果最好，對水楊苷的水解效果其次，對纖維二糖和京尼平苷的水解效果較差，對甜菊苷的水解效果最弱。

2.3.5 不同金屬離子對β-葡萄糖苷酶活力的影響 選取氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鈷為試劑。在酶反應液中分別加入上述金屬離子， 使其終濃度為 1.0 mmol/L， 于60 ℃溫30 min，按常規法測定對應的酶活力，以不加金屬離子的酶活力為100%。從表2可以看出，金屬陽離子對該酶都有不同程度的影響，其中Fe2+、Na+和Ca2+對酶活力有輕微的激活作用，而Mg2+和Co2+則有一定的抑制作用。

3 結論

本試驗通過初篩和復篩得到1株霉菌，可將虎杖苷轉化為白藜蘆醇，經形態學鑒定為青霉菌屬。對其所產酶的酶學性質進行了研究，結果表明：酶的最適pH值為5.0，pH值在4.0～6.0之間時，酶的穩定性較好;酶最適反應溫度為 60 ℃，并且在該溫度下具有較好的熱穩定性;Fe2+、Na+和Ca2+對酶活力有激活作用;虎杖苷是該酶理想的水解作用底物。

本試驗的結果可以拓展白藜蘆醇的制備途徑[17]，增加虎杖的利用價值。可以用虎杖中藥材為原料，先提取虎杖苷，利用該菌株所產的酶液轉化虎杖苷，或將酶液制成固定化酶再將虎杖苷轉化成白藜蘆醇。另外，還可以將虎杖藥材粉碎后與該菌進行共發酵，從發酵后的固體曲中提取白藜蘆醇。

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