增生性瘢痕組織中腫瘤壞死因子αR1 mRNA的表達及意義

李勇鐵 鄒永紅 劉德伍

【摘要】 目的：分析腫瘤壞死因子α受體1（TNF-αR1）在增生性瘢痕組織中基因表達情況，為今后從基因方面治療增生性瘢痕提供依據。方法：選取48例增生性瘢痕組織患者為觀察組（其中瘢痕組織增生時間1～3、4～6、7～12個月及1年以上各12例），12例正常瘢痕組織患者為對照組，以RT-PCR法對瘢痕組織中TNF-αR1 mRNA表達進行檢測，比較各組TNF-αR1 mRNA水平差異。結果：對照組TNF-αR1 mRNA表達均高于觀察組不同時間點TNF-αR1 mRNA表達，差異有統計學意義（P<0.05），且1年以上組織TNF-αR1 mRNA表達量均高于1～3、4～6、7～12個月組織（P<0.05）。結論：增生性瘢痕組織中TNF-αR1 mRNA表達低于正常瘢痕組織，同時隨著時間增加增生性瘢痕中TNF-αR1 mRNA表達會顯著上升。

【關鍵詞】 瘢痕組織; 增生性; RT-PCR; 表達; 腫瘤壞死因子α受體1

【Abstract】 Objective：To analyze the gene expression of tumor necrosis factor α receptor 1（TNF-αR1）in hypertrophic scar tissue，and to provide evidence for gene therapy of hypertrophic scar in the future.Method：48 patients with hypertrophic scar tissue were selected as observation group（the scar proliferation time at 1-3，4-6，7-12 months and over 1year were occurred in 12 cases respectively）and 12 patients with normal scar tissue as control group.The expression of TNF-αR1 mRNA in scar tissue was detected by RT-PCR.The differences in TNF-αR1 mRNA levels among groups were compared.Result：The expression of TNF-αR1 mRNA in control group were higher than those of observation group at different time points（P<0.05），and the expression of TNF-αR1 mRNA in tissues over one year was higher than those of tissues over 1-3，4-6，7-12 months（P<0.05）.Conclusion：The expression of TNF-αR1 mRNA in hypertrophic scar tissue was lower than that of normal scar tissue，at the same time，the expression of TNF-αR1 mRNA in hypertrophic scar increased significantly with time.

【Key words】 Scar tissue; Hyperplastic; RT-PCR; Expression; Tumor necrosis factor α receptor 1

First-authors address：Jian Central Hospital，Jian 343000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.17.041

增生性瘢痕是臨床一種皮膚創面病理改變，為局部創面修復中組織過度增生形成，主要表現為顏色轉變、痕突高低不平、質地實韌等，多發于真皮創傷，但也會出現于手術切口、較深的創傷[1]。目前增生性瘢痕治療以手術為主，其只能起到縮小、改善的作用無法達到除去瘢痕效果，但隨著人們對美觀需求日益增加，如何有效治療增生性瘢痕得到臨床關注。近些年隨著臨床對增生性瘢痕研究深入，發現瘢痕過度形成中有多種細胞因子參與，而腫瘤壞死因子α（TNF-α）更在其中發揮重要作用，此因子由T淋巴細胞產生，參與自身免疫、炎癥、休克等多種病理過程，不僅能殺傷腫瘤細胞，還能影響機體成纖維細胞分解、膠原合成[2-3]。而TNF-αR1作為TNF-α的受體1，其數目的多少，則將直接影響TNF-α的敏感性，即當TNF-αR1數目較多時，TNF-α就可更好地通過與TNF-αR1的結合而增加膠原酶和蛋白多糖酶的合成。Peruccio等[4]發現在增生性與正常瘢痕組織中TNF-α浸潤細胞有明顯差異，增生性組織陽性率低于正常組織，但其未就TNF-α基因動態表達、作用機制等進一步闡述。故本文通過觀察正常及不同增生瘢痕組織中TNF-αR1基因表達情況，分析其在增生瘢痕形成、發展的意義，旨在為今后增生性瘢痕治療提供依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取筆者所在醫院2017年3月-2018年9月收治的增生性瘢痕組織患者48例為觀察組，正常瘢痕組織患者12例為對照組。納入標準：患者無言語、精神障礙;未合并惡性腫瘤、免疫性疾病;無外用瘢痕治療藥史;對照組組織顏色與正常皮膚相近，創面愈合時間3年以上。排除標準：患者臨床資料不全，有長期免疫調節劑服用史;組織存在紅腫、充血、潰爛情況。標本獲取經患者知情同意、簽署知情同意書，醫院倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 儀器、試劑 分光光度儀（型號：Ultrospec3000，美國Pharmacia Biotech），TNF-αR1、β-actin引物由中山大學安達基因股份有限公司合成，PCR基因擴增檢測儀（型號：ABI75000，北京欣興強森生物科技有限公司），TD-2Y多功能離心機（中山市生科試劑儀器有限公司），RT-PCR試劑盒（中山大學達安基因有限公司），TRIzol Reagent總RNA提取試劑盒（美國英杰生命技術有限公司），凝膠成像分析系統（WD0413C型，北京）。

1.2.2 方法 （1）總RNA提取：將正常、增生性瘢痕組織，放入研缽加液氮冷凍，即刻研磨成粉末，研磨期間注意不斷加液氮，然后室溫放置2～3 min，將研磨組織移入離心管中，加TRIzol充分振蕩，并靜置5 min以使組織、細胞裂解充分，后行離心處理（12 000 g，10 min）去除沉淀。加氯仿抽提3 min，行高速離心處理（12 000 g，15 min，4 ℃），吸取上清液，加異丙醇沉淀RNA，再行高速離心（12 000 g，30 s，4 ℃），棄除濾液，重洗沉淀，并再次離心處理（12 000 g，130 s），稍微干燥后加無RNA酶水溶解，以獲得總RNA。經電泳鑒定，所有樣本D260/D280值在1.8以上，表明樣品無明顯蛋白污染，純度較高，后調整總RNA濃度為0.5 mg/μL。（2）引物設計、PCR循環數：應用相關軟件設計引物，設計上下游引物時為避免RNA中污染基因DNA擴增導致假陽性，需要將其設計在不同外顯子上，本次以β-actin為內源性內參照。行定量PCR擴增，TNF-αR1 mRNA共28個循環，擴增產物為210 bp，β-actin mRNA共26個循環，擴增產物長540 bp。（3）PCR反應：每個標本取總RNA 2 mL，行RT-PCR反應，按試劑盒操作，取定量PCR反應產物行瓊脂糖凝膠電泳，并以凝膠掃描成像分析儀行光密度掃描，以獲取電泳條帶的光密度，檢測正常、增生性瘢痕組織中TNF-αR1 mRNA表達的變化，以目的基因mRNA與內參照β-actin mRNA比值表示。TNF-αR1引物上游：5CCATCTGCTGCACCAAGTGCCA-3;下游：5AATCCTGCGTGGCAGTTACACA-3。β-actin引物上游：5GTGGGGCGCCCCCAGCCA-3;下游：5CTCCTTATTGTCCACGATTTC-3。

1.3 觀察指標 分析TNF-αR1 mRNA表達情況，比較不同增生時間組織中TNF-αR1 mRNA水平差異。

1.4 統計學處理 使用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基線資料比較 觀察組男10例、女38例，年齡19～48歲，平均（30.5±4.2）歲，組織增生時間：1～3個月12例、4～6個月12例、7～12個月12例、1年以上12例。對照組男3例、女9例，年齡20～49歲，平均（30.7±4.1）歲。兩組性別、年齡資料比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 瘢痕組織TNF-αR1 mRNA表達 從增生瘢痕1～3、4～6、7～12個月及1年以上至正常瘢痕組織，值從左至右依次降低（TNF-αR1 mRNA表達量呈上升狀態），見圖1。

2.3 各組TNF-αR1 mRNA表達比較 觀察組1～3、4～6、7～12個月及1年以上的TNF-αR1 mRNA相對表達量分別為（0.53±0.13）、（0.78±0.15）、（0.96±0.19）、（1.27±0.43），對照組TNF-αR1?mRNA相對表達量為（1.58±0.47），對照組TNF-αR1 mRNA表達均高于觀察組不同時間點TNF-αR1 mRNA表達，差異有統計學意義（F=28.558，P=0.000），且1年以上組織TNF-αR1 mRNA表達量均高于1～3、4～6、7～12個月組織（F=20.739，P=0.000）。

3 討論

人體受損皮膚通過新真皮、再上皮化形成來使創面愈合，其中新生真皮以肉芽組織填充為主，而肉芽組織為受損組織周圍結締組織（成纖維細胞、毛細血管、肌成纖維細胞等）生成[5]。臨床發現在人體創面愈合過程中，不僅需要分子信號刺激相關細胞增殖，同時還要限制細胞增殖程度，避免過度修復造成不良影響，而一系列行為主要由程序性細胞凋亡控制[6]。而目前已知細胞凋亡除了受死亡受體Fas介導外，TNF-αR1也是一種可促細胞凋亡的死亡受體，臨床認為其介導細胞凋亡在瘢痕形成過程發揮重要作用。同時已有研究證實抗TNF-α抗體陽性細胞所占比例在增生性瘢痕生長過程呈上升趨勢，其提示TNF-α可能在增生性瘢痕發展中起重要作用，但與正常瘢痕比較，陽性細胞所占比例仍降低，推測可能與存在多種TNF抑制物、T淋巴細胞、巨噬細胞功能性降低有關[7-9]。

本次研究采用RT-PCR法對瘢痕組織中TNF-αR1 mRNA表達進行測定，結果顯示，對照組TNF-αR1 mRNA表達均高于觀察組不同時間點TNF-αR1 mRNA表達（P<0.05），且1年以上組織TNF-αR1mRNA表達量均高于1～3、4～6、7～12個月組織（P<0.05）。本次對TNF-αR1基因表達采用RT-PCR檢測，其作為臨床新型檢測技術，自動化高、特異性強，能夠將基因檢測從定性轉化為定量，準確度提高，同時本次計算TNF-αR1相對定量，能排除反應體系中可能出現的一切影響因素，較絕對定量的結果科學性、準確度高[10]。結果表明增生性瘢痕TNF-αR1基因轉錄水平低下，提示激活的T細胞及巨噬細胞功能低下，是組織TNF-α蛋白質水平降低的根本原因。且隨著增生瘢痕逐漸成熟，組織中TNF-αR1基因轉錄水平也隨之上升，表明在瘢痕成熟過程中激活的T細胞及巨噬細胞功能會有增強，臨床認為這可能與糖皮質激素、腎上腺素等抑制T、巨噬功能物質水平降低及INF-γ等含量緩慢降低有關[11-12]。

有研究表明TNF-α可雙向調節成纖維細胞，高濃度時可促纖維細胞處于增殖狀態，而低濃度時能有效抑制細胞增殖，其雙向調節機制可能與TNF-αR1作用成纖維細胞時介導的信號轉導途徑不同有關[13]。早期有學者認為低濃度TNF-α通過促聚胺多糖Ⅰ、Ⅲ型膠原合成來達到促成纖維細胞增殖的目的，但相關體外實驗表明，TNF-α可促成纖維細胞增殖主要是通過直接誘導成纖維細胞增殖的信號轉導而發揮作用[14]。文獻[15]顯示TNF-α可促人滑膜成纖維細胞增殖，來增加膠原酶合成，使膠原降解，而后期大量實驗也證明了高濃度TNF-α能對成纖維細胞增殖產生抑制作用，還會減少細胞外基質合成，從而使組織中沉積減少，故而臨床推測TNF-α在高濃度時，TRADD介導信號傳遞致細胞凋亡，從而達到抑制細胞增殖目的，同時由于細胞減少，使細胞外基質分泌、沉積減少，這有利于抑制增生性瘢痕形成[16-17]。本研究中增生性瘢痕隨增生時間的增加，TNF-αR1含量逐步增加，臨床認為當TNF-αR1含量處于低濃度時，會刺激機體內細胞增殖，從而使膠原酶合成增加，加速瘢痕主要成分膠原降解，使增生性瘢痕逐漸向正常瘢痕轉變，故而TNF-αR1含量會增加[18]。因此筆者推測增生性瘢痕形成、發展可能與TNF-α基因逆轉錄水平降低有關，臨床在抑制、治療增生性瘢痕時可通過基因轉染技術將TNF-αR1基因導入瘢痕成纖維細胞中，從而提高靶細胞敏感性，促發揮TNF-α發揮治療作用，達到抑制增生性瘢痕形成的目的[19-20]。

綜上，增生性瘢痕組織中TNF-αR1 mRNA表達低于正常瘢痕組織，同時隨著時間增加增生性瘢痕中TNF-αR1 mRNA表達會顯著上升。

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（收稿日期：2018-10-29） （本文編輯：董悅）