甾體衍生物02F04通過非核受體上調PAM212細胞胸腺基質淋巴細胞生成素的研究①

翁 琰 平澤典保 李子敏 廖禹程 王 霞 楊志福 王婧雯 奚苗苗 張玲琴 文愛東

(中國人民解放軍空軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科,西安710032)

胸腺基質淋巴細胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是一種新型的、與白介素7(Interleukin-7，IL-7)類似的Ⅰ型細胞因子[1]，主要由上皮細胞分泌，特別是經抗原激活的支氣管上皮細胞、皮膚角化細胞、基質細胞、肥大細胞、平滑肌細胞和肺成纖維細胞[2]。TSLP可以支持B淋巴細胞的生長、分化以及T 細胞增殖，并能在缺乏IL-7的條件下促進淋巴細胞的發育[3]，尤其對樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)的活化、分化、成熟和遷移具有重要的調控作用[4]。近年研究發現，TSLP是過敏性炎癥的一個重要啟動因子。過敏原刺激上皮細胞后，細胞中TSLP表達上調，從而產生Th2生成傾向的微環境，分泌Th2型細胞因子，生成炎癥反應性Th2細胞，進而觸發過敏性炎癥反應[5]。因此，TSLP對呼吸道感染和非特異性炎癥過程有廣泛的免疫調節作用，出現在多種變態反應性疾病中，如過敏性鼻炎、過敏性哮喘、濕疹等[6，7]；而誘導TSLP產生的化合物如二甲苯和壬酸等也因能增加對抗原的敏感性而加速了過敏炎癥反應，從而被鑒定為炎癥加速器[8,9]。因此，TSLP作為治療過敏性疾病的一種主要靶分子，明確誘導TSLP產生的化合物及其作用靶點可以潛在地預防過敏性疾病的發生。

TSLP表達的一個主要特點是受激素調節。研究已表明幾個核受體如視黃酸受體(Retinoic acid receptor，RAR)，維甲酸X受體(Retinoid X receptor，RXR)，過氧化物酶體增生物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)，維生素D受體(Vitamin D receptor，VDR)和糖皮質激素受體(Glucocorticoids receptor，GR)參與并調節了TSLP的產生[10-14]。目前，甾體化合物如糖皮質激素可以減輕炎癥已廣為人知，而其中涉及通過作用于GR而下調TSLP表達的作用機制也已被闡明。然而，迄今為止，未見有甾體化合物誘導TSLP產生的研究報道。本課題組發現了一個具有甾體結構的化合物02F04在小鼠角質細胞PAM212中誘導TSLP的產生[15]。02F04具有甾體生物堿結構，且其甾體結構與肝X受體(Liver X receptor，LXR)的內源性配體如22(R)-羥基膽固醇[22(R)-hydroxycholesterol，22R-HC]完全一致(圖1)。然而，02F04誘導的TSLP表達是否該甾體結構有關、是否通過作用于核受體而介導仍然不得而知。因此，本實驗就此進行了詳細的研究，為探索類似結構的甾體化合物在誘導TSLP產生的作用機制提供重要的參考依據。

圖1 02F04和22(R)-羥基膽固醇的化學結構式Fig.1 Chemical structures of 02F04 and 22(R)-hydroxycholesterol

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 胎牛血清(法國Biowest公司)，小牛血清(美國MP Biomedicals公司)，MEMα培養粉(美國Invitrogen公司)，胰蛋白酶(美國Gibco公司)，小鼠TSLP ELISA試劑盒(美國R&D Systems公司)，牛血清白蛋白和焦碳酸二乙酯(美國Sigma-Aldrich公司)，RNAiso plus、PrimeScriptTMRT Master Mix和SYBR premix Ex TaqⅡ(日本TaKaRa公司)，ELISA POD Substrate TMB試劑盒(日本Teaque公司)，氯仿、乙醇、異丙醇和磷酸(日本和光純藥工業公司)。

02F04購自俄羅斯InterBioScreen公司；曲格列酮、地塞米松、BMS 753、LG 100268、GW 9662、GSK 3787、GW 501516和MC903購自美國Sigma-Aldrich公司；BMS 195614和MM 11253購自英國Tocris生物科技公司；HX 531購自日本乙卯研究所；米非司酮購自法國Roussel-Uclaf公司；BMS 189961購自荷蘭Axon Medchem公司。

1.1.2 儀器 iMark吸收光酶標儀(美國Bio-Rad公司)，NanoDrop?2000紫外-可見光分光光度計(美國賽默飛公司)，梯度PCR 擴增儀和TP800實時熒光定量PCR儀(日本TaKaRa公司)。

1.1.3 細胞 PAM212 是BALB/c小鼠皮膚來源的角質細胞，由美國國立衛生研究院Stuart H Yuspa教授饋贈。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與接種 將PAM212細胞分裝于直徑為10 cm的培養皿中，按常規方法培養，即用含10%胎牛血清的MEMα培養液，置于37℃、CO2體積分數為5%的恒溫恒濕培養箱中培養。當細胞長滿至80%～90%時，先用PBS洗滌2次，再加入胰蛋白酶消化細胞，并用小牛血清終止消化，收集消化液，離心后去除上清液，沉淀用含10%胎牛血清的MEMα培養液制成細胞懸液，并調整細胞濃度為每1 ml含1.0×105個PAM212細胞的懸液，接種于細胞培養板中，常規培養。

1.2.2 細胞處理和分組 PAM212細胞接種24 h后，PBS洗滌2次，更換培養基并給予各種刺激，包括各種不同濃度的核受體(RARα，RARγ，RXR，PPARγ，PPARδ，VDR，GR或LXR)激動劑或抑制劑，細胞根據處理情況分為02F04單獨刺激組、空白對照組以及各種激動劑或抑制劑與02F04聯合給藥組，各組均給藥刺激24 h后測定TSLP蛋白濃度。此外，02F04單獨刺激PAM212細胞4、8、12或24 h，測定相關核受體的靶基因表達；02F04與LXR激動劑或抑制劑單獨給藥或聯合給藥4 h，測定LXR靶向基因三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)的表達。

1.2.3 細胞培養上清液中TSLP蛋白濃度檢測 藥物刺激細胞至指定時間后，收集上清液，按TSLP ELISA試劑盒說明書操作，在450 nm處測吸光度值，并在570 nm處進行波長校正。通過繪制標準曲線求出樣品中TSLP的實際濃度。

1.2.4 MTT法檢測PAM212細胞的存活率 1.2.3中收集細胞上清液后，PBS洗滌細胞2次，每孔加入10%MTT-PBS溶液(含5 mg/ml噻唑藍)繼續孵育4 h，棄上清后加入DMSO溶解產生的藍紫色結晶甲瓚，于570 nm 波長處測定每孔吸光度(A)值，按下列公式計算細胞存活率，細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.2.5 實時熒光定量PCR 反應 用RNAiso Plus提取總RNA，逆轉錄為cDNA。PCR反應體系10 μl，擴增程序為：①熱變性：95℃30 s，循環1次；②PCR反應：95℃5 s，60℃30 s，循環40次；③融解：95℃15 s，60℃30s，95℃15 s，循環1次。根據融解點來確定擴增產物的特異性。使用二階導數最大值法計算擴增產物的熒光信號達到設定閾值時所經過的擴增循環次數(Ct)，以GAPDH基因的Ct作為內參對照，用2^(內參基因Ct值-目的基因Ct值)計算目的基因的相對表達。引物由日本Fasmac公司合成，mGAPDH(forward: 5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′;reverse:5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′)，mTSLP(for-ward:5′-AGCTTGTCTCCTGAAAATCGAG-3′，rever-se:5′-AGGTTTGATTCAGGCAGATGTT-3′)，mCRAB-P2(forward:5′-TCCACCACTGTGCGAAC-3′，reverse:5′-CGGAAGTCGTCAGGCAGT-3′)，mTGM2(forward:5′-GGTGATCCTCGCTTGAGTGT-3′，reverse:5′-CTCCAAATCACACCTCTCCAG-3′)，mPLIN2(forward:5′-GACCTCTGCGGCCATGAC-3′，reverse:5′-GTATTGGCAACCGCAATTTGT-3′)。

2 結果

2.1 02F04呈濃度及時間依賴性地增加PAM212細胞中TSLP因子的表達 不同濃度的02F04刺激PAM212細胞24 h時，TSLP的蛋白水平如圖2A所示。02F04能顯著刺激PAM212細胞中TSLP表達的上調，且在0.3～30 μmol/L范圍內，隨著02F04刺激濃度的增加，PAM212細胞中TSLP的產生增多。然而，當02F04的濃度為30 μmol/L時，細胞存活率急劇降低至55.8%。因此，后續實驗選擇02F04的濃度為10 μmol/L進行進一步考察。圖2B表明隨著02F04刺激時間的延長，PAM212細胞的TSLP基因表達量也在不斷增加，24 h與對照組比已有顯著性差異(P<0.001)，48 h表達進一步增加。

2.2 PAM212細胞中TSLP 的表達與VDR無關 VDR激動劑MC903在0.3～10 μmol/L范圍內刺激PAM212細胞24 h，對細胞存活率沒有顯著影響，TSLP表達也沒有變化(圖3)。表明MC903不影響PAM212細胞中TSLP的產生。

圖2 02F04對PAM212細胞TSLP表達的影響Fig.2 Effect of 02F04 on TSLP expression in PAM212 cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs the corresponding control；A.■.TSLP production;-◇-.Cell viability；B.Values in the control group with treatment for 8 h were set to 1.0.

圖3 VDR激動劑不能誘導PAM212細胞中TSLP的表達Fig.3 TSLP expression in PAM212 cells was not induced by agonist of VDRNote: ■.TSLP production;-◇-.Cell viability.

2.3 02F04誘導的TSLP表達與RAR無關 圖4A表明，RARα激動劑BMS 753和抑制劑BMS 195614分別在1～10 μmol/L范圍內單獨刺激PAM212細胞24 h，均不影響細胞存活率及TSLP的產生；與02F04聯合使用時，也不影響細胞存活率，且與02F04單獨刺激產生的TSLP比較均無顯著性差異。圖4B表明，RARγ激動劑BMS 189961和RARγ抑制劑MM 11253單獨刺激或與02F04聯合使用時，在不影響細胞存活率的基礎上，均呈濃度依賴性地降低對照組及02F04刺激組的TSLP水平。由圖4C可知，02F04刺激PAM212細胞24 h內，RAR靶向基因CRABP2的表達與對照組比較無顯著變化，且未測得RAR的另一靶向基因CYP26A1的表達。結果表明：02F04誘導的TSLP產生與RAR無關。

2.4 02F04誘導的TSLP表達與RXR無關 圖5A表明，RXR激動劑LG 100268和抑制劑HX 531分別在0.3～3 μmol/L范圍內，單獨刺激或與02F04聯合使用時，均對細胞存活率無顯著影響。LG 100268雖然能降低對照組及02F04刺激組的TSLP表達水平，高濃度的HX 531單用也能降低對照組的TSLP表達， 而又不改變02F04誘導的TSLP水平。RXR靶向

圖4 RAR對02F04誘導的TSLP表達的影響Fig.4 Effect of RAR on 02F04-induced TSLP expressionNote: *.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001 vs the non-stimulated group;##.P<0.01，###.P<0.001 vs 02F04 alone.A，B.■.TSLP production;-◇-.Cell viability；C.Values in the control group with treatment for 4 h were set to 1.0.

基因TGM2的表達如圖5B所示，可見02F04刺激PAM212細胞24 h內，TGM2的表達無顯著變化。結果表明：02F04誘導的TSLP表達與RXR無關。

2.5 02F04誘導的TSLP表達與PPAR無關 PPARγ激動劑曲格列酮與抑制劑GW 9662以及PPARδ激動劑GW 501516與抑制劑GSK 3787，分別單獨使用或與02F04聯合刺激PAM212細胞時，TSLP的表達與細胞存活率如圖6A和B所示。除了30 μmol/L曲格列酮與02F04聯合刺激組的細胞存活率降至80%以下外，其他刺激組細胞均未出現明顯毒性；激動劑或抑制劑的加入不能改變對照組以及02F04誘導組的TSLP表達?；蛩綑z測結果表明，02F04刺激PAM212細胞24 h內，不影響PPAR的靶向基因PLIN2的表達(圖6C)。因此，02F04誘導的TSLP表達與PPAR無關。

2.6 02F04誘導的TSLP表達與GR無關 GR激動劑地塞米松在0.1～1 μmol/L范圍內，顯著降低對照組及02F04誘導組的TSLP表達(圖7A)。然而，GR抑制劑米非司酮并沒有出現相反的作用，而是顯著降低了02F04誘導的TSLP 產生(圖7B)。結果表明：02F04誘導的TSLP產生與GR無關。

2.7 02F04激活LXR，但與其誘導的TSLP表達無關 圖8A表明，LXR激動劑22R-HC刺激PAM212細胞4 h，顯著增加了LXR靶向基因ABCA1的表達(P<0.001)，而同時合用LXR抑制劑GSK2033后，ABCA1的表達被顯著抑制(P<0.05)。10 μmol/L 02F04刺激PAM212細胞后4 h也顯著增加了ABCA1的表達(P<0.001)， 增加程度與10 μmol/L

圖5 RXR對02F04誘導的TSLP表達的影響Fig.5 Effect of RXR on 02F04-induced TSLP expressionNote: **.P<0.01，***.P<0.001 vs the non-stimulated group;#.P<0.05，###.P<0.001 vs 02F04 alone.A.■.TSLP production;-◇-.Cell viability；C.Values in the control group with treatment for 4 h were set to 1.0.

圖6 PPAR對02F04誘導的TSLP表達的影響Fig.6 Effect of PPAR on 02F04-induced TSLP expressionNote: *.P<0.05，***.P<0.001 vs the non-stimulated group.A，B.■.TSLP production;-◇-.Cell viability；C.Values in the control group with treatment for 4 h were set to 1.0.

圖7 GR對02F04誘導的TSLP表達的影響Fig.7 Effect of GR on 02F04-induced TSLP expressionNote: *.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001 vs the non-stimulated group;#.P<0.05，##.P<0.01，###.P<0.001 vs 02F04 alone.■.TSLP production;-◇-.Cell viability.

22R-HC相當，并能被GSK2033顯著抑制(P<0.01)，表明02F04有類似LXR激動劑的作用，能激活LXR并增加ABCA1的表達。

研究02F04誘導的TSLP表達是否通過激活LXR介導，結果發現，PAM212細胞被刺激24 h 后，在不影響細胞存活率的基礎上，22R-HC不能誘導TSLP的產生，GSK2033也不能抑制02F04誘導的TSLP產生(圖8B)。表明02F04雖然能激活LXR，但是02F04誘導的TSLP表達不是通過激活LXR產生的。

3 討論

TSLP是上皮細胞來源的細胞因子，對樹突狀細胞的極化和Th2類細胞因子的產生有極其重要的影響。TSLP可觸發DCs介導的Th2類炎癥反應，在過敏性疾病的發生中扮演著重要的角色，是過敏性炎癥的重要啟動因子之一[16]。誘導TSLP產生的化合物可以增加機體對抗原的敏感性從而加速過敏性炎癥反應的發生。因此，鑒定能夠誘導TSLP產生的化合物可以預防過敏性疾病的發生及進一步惡化。具有甾體結構的02F04雖然顯著增加了PAM212細胞中TSLP的表達，但是其誘導的TSLP產生過程比較緩慢且持續，TSLP的基因水平在02F04刺激至48 h時仍一直在增加，這與其他誘導TSLP產生的化合物如豆蔻酰佛波醇乙酯相比完全不同。分析原因，02F04的化學結構完全不同于目前已知的TSLP生成誘導劑。

圖8 02F04通過介導LXR上調ABCA1的表達，而其誘導的TSLP產生與LXR無關Fig.8 Involvement of LXR in 02F04-induced ABCA1 but not TSLP expressionNote: *.P<0.05，***.P<0.001 vs the non-stimulated group;#.P<0.05，##.P<0.01 vs.02F04 alone.B.■.TSLP production;-◇-.Cell viability.

核受體超家族是一組配體激活的轉錄因子家族，通過在信號分子與轉錄應答間建立聯系，調控著細胞的生長和分化。研究已表明核受體RAR和VDR的激動劑可以誘導TSLP的表達，RXR、PPAR和GR的激動劑可抑制TSLP的產生[10-14]。另外，02F04的甾體結構與LXR的內源性配體22R-HC完全一致，因此應首先考慮02F04誘導的TSLP表達是否通過作用于核受體而產生。結果表明，02F04不能誘導RAR、RXR和PPAR靶向基因的表達，RAR、RXR、PPAR和GR的激動劑及抑制劑單用或者與02F04合用后，PAM212細胞中TSLP的產生也沒有出現規律性的變化。此外，VDR激動劑MC903也不影響PAM212細胞中TSLP的表達。雖然02F04有類似LXR激動劑的作用，能與22R-HC一樣程度地增加ABCA1的表達，且增加的ABCA1均能被LXR拮抗劑顯著地抑制，但是02F04誘導的TSLP表達不是通過激活LXR產生的。因為LXR激動劑不能誘導TSLP的產生，LXR拮抗劑也不能抑制02F04誘導的TSLP表達。所以，02F04雖然具有甾體結構，但是其誘導TSLP產生的作用不是通過核受體介導的。實驗證明02F04刺激PAM212細胞后，ABCA1和TSLP基因表達的峰值分別出現在4 h和48 h或更長時間，這個差異很大的達峰時間也間接反映02F04可能通過不同的作用機制誘導ABCA1和TSLP表達。因此，推測02F04是通過細胞內信號通路而不是核受體誘導了TSLP的表達。已有不少研究報道了細胞內信號通路如MAPK、NFκB、RAR-RXR、ROCK和Gq/11等可以參與TSLP的產生[17,18]。02F04具有與以往報道的TSLP生成誘導劑不同的化學結構，02F04是否能激活細胞內信號通路、具體通過哪種信號通路誘導TSLP的產生將是我們下一步的研究內容。