莫諾苷對小鼠骨髓源樹突狀細胞表型及功能的影響

李慈，張燕，周婧文，仇欣，吳儀，趙傳祥，高鳳威，周文慧，劉爍，姚雪，夏圣

（江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013）

莫諾苷（morroniside）是一種從山茱萸中提取的物質，可以促進神經功能的恢復［1-3］。也有研究顯示，莫諾苷對預防糖尿病血管病發揮有益作用［4］。據報道，莫諾苷有抗氧化和抗凋亡的作用［5］，可通過細胞外基質和細胞黏附分子促進骨髓間充質干細胞增殖［6］。這些結果均表明莫諾苷具有許多生物學活性，與免疫系統密切相關。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）作為最重要的抗原提呈細胞，在免疫應答的起始和調節過程中起著關鍵作用，迄今為止莫諾苷對樹突狀細胞的調節作用尚不明確。為此，本實驗利用小鼠骨髓源樹突狀細胞（bone-marrow derived dendritic cells，BMDCs），探究莫諾苷對其分化、表型和功能的影響，為莫諾苷的開發應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠（No.201907363）購于江蘇大學動物中心，H2-Kb-OVA323-339肽抗原特異性OTⅡ小鼠（No.004194）購于Jackson Laboratory。所有實驗均使用6～12周齡的雌性小鼠。

1.2 主要試劑及儀器

RPMI 1640培養基（上海源培生物公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；12孔細胞培養板（韓國Spl Life Sciences公司）；96孔細胞培養板（Nunc公司）；莫諾苷（成都普瑞法科技開發有限公司）；脂多糖、卵清蛋白（Sigma公司）；羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）熒光染料（Invitrogen公司）；CD11c-Percpcy5.5、CD11b-APC、CD80-PE、CD86-PE、MHC-I-PE、MHC-Ⅱ-PE、CD4-APC、CD69-FITC和CD25-Percp-cy 5.5（eBioscience公司）；小鼠Naive CD4+T細胞磁分選試劑盒（Stem Cell公司）；小鼠IL-6、IL-12p70 ELISA試劑盒（杭州聯科生物有限公司）；酶標儀（Rayto公司）；細胞培養箱（Thermo公司）；熒光倒置顯微鏡（Axiovert 200M，德國 Zeiss公司）；Accuri C6流式細胞儀、FACSCautoTMⅡ流式細胞儀（BD公司）。

1.3 小鼠BMDCs的體外培養

BMDCs的體外培養參照文獻［7］進行。處死C57BL/6小鼠，使用無菌PBS沖洗股骨和脛骨，從骨髓腔中制備骨髓細胞。培養基為含10%胎牛血清、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF，10 ng/mL）、IL-4（1 ng/mL）的RPMI 1640，培養條件為37℃、5%CO2。每隔1天，半量換新鮮培養基并加入莫諾苷刺激（終濃度10μmol/L），7 d后收集懸浮細胞并進行磁珠分選，得到CD11c+細胞，作為未成熟的BMDCs，成熟的BMDCs則需經過脂多糖（終濃度1μg/mL）誘導18～24 h。

在培養過程中半量換新鮮培養基不加莫諾苷和脂多糖刺激的細胞作為對照組，只加莫諾苷刺激的為莫諾苷組，只加脂多糖刺激的為脂多糖組，莫諾苷和脂多糖均加的為莫諾苷+脂多糖聯合處理組。

1.4 流式細胞術檢測莫諾苷刺激后BMDCs的分化效率

取“1.3”中獲得的骨髓細胞，加入熒光染料CFSE（終濃度2.5μmol/L），避光、37℃孵育10min。加入含10%胎牛血清的RPMI 1640溶液10 mL終止反應，4℃、1 000 r/min離心5min，再用 PBS洗1遍。每隔1天，半量換新鮮培養基并加入莫諾苷（10 μmol/L）進行培養，第7天，在光學顯微鏡下觀察細胞形態，并進行拍照。收集細胞并計數，標記CD11c熒光抗體，4℃孵育30 min，PBS洗細胞2遍后，流式細胞儀檢測CD11c+群體數以及CFSE的熒光強度。

1.5 流式細胞術檢測BMDCs膜表面CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子的表達

將誘導培養7 d的BMDCs按每孔1×106細胞加入到12孔板中，經過18～24 h脂多糖刺激后，收集細胞。標記 CD11b、CD11c、CD80、CD86，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ熒光抗體，4℃孵育30 min，PBS洗細胞2遍后，再用流式細胞分析儀檢測CD11b和CD11c雙陽性群體中 CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子的表達情況。使用Flowjo軟件分析數據。

1.6 ELISA法檢測BMDCs培養上清液中IL-6和IL-12的分泌

收集C57BL/6小鼠BMDCs的培養上清液，按ELISA試劑盒操作步驟檢測IL-6、IL-12p70的分泌量。

1.7 流式細胞術檢測抗原特異性CD4+T細胞體外活化的能力

BMDCs細胞的處理與準備同“1.3”。將OVA323-339肽與BMDCs共孵育6 h。取肽抗原特異性OT-Ⅱ小鼠脾臟，制備單細胞懸液，無菌PBS洗2遍，用分選緩沖液將細胞數調整為1×108/mL，置于流式管中。向1 mL細胞懸液中加入小鼠血清50 μL/mL；加入 CD4+T細胞分離液60μL/mL，室溫7.5 min；加入記憶 T細胞去除液60μL/mL，室溫2.5 min；加入 Streptavidin Rapid SpheresTM50001 70μL/mL，室溫 2.5 min；加分選緩沖液定容至3 mL，混勻，轉移至磁架上，室溫2.5 min。將上清液轉移至新的流式管中，用1 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640重懸計數后，將OT-Ⅱ TCR轉基因小鼠的CD4+T細胞與經OVA323-339處理的BMDCs共培養，以 CD4+T（2×105）∶BMDCs（2×104）的比例鋪入96孔U底板中，37℃、5%CO2培養4 d后，將細胞標記CD4-APC、CD69-FITC和CD25-Percp-cy5.5熒光抗體，流式細胞儀檢測CD4+T細胞的活化。

1.8 流式細胞術檢測抗原特異性CD4+T細胞體外增殖的能力

BMDCs細胞的前期處理與準備同“1.7”。將磁珠分選的上清液轉移至新的流式管后，用1 mL PBS重懸計數，加 CFSE溶液（5μmol/L），避光、37℃孵育10 min。用10 mL含10%胎牛血清的RPMI1640終止反應，PBS洗2遍。以CD4+T（2×105）∶BMDCs（2×104）的比例鋪入96孔U底板中，37℃、5%CO2孵育4 d后，將細胞標記CD4-APC熒光抗體，流式細胞儀檢測CD4+T細胞的增殖。

1.9 流式細胞術檢測抗原特異性CD4+T細胞體外分化的能力

BMDCs細胞的前期處理與準備同“1.7”。當共培養到第4天后，提前5 h向培養體系中加入布雷非德菌素A（BFA）與佛波酯（PMA）試劑，再分別對細胞進行CD4-APC熒光抗體染色20 min、IC Fixation（胞內固定）溶液避光孵育 20 min、IFN-γ-PE熒光抗體染色20 min后，流式細胞儀檢測CD4+T細胞向Th1分化的能力。

1.10 統計學分析

應用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學分析，兩組之間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 莫諾苷對BMDCs形態和分化效率的影響

如圖1所示，與對照組相比，莫諾苷作用后BMDCs的形態和大小以及細胞聚團均無明顯影響；細胞總數也無明顯差異，對照組細胞數為6.4×106，莫諾苷組細胞數為6.0×106。流式檢測結果（圖2）顯示，莫諾苷處理后，細胞的CFSE熒光強度未發生明顯偏移。

圖1 莫諾苷處理后BMDCs的形態（光學顯微鏡×40）

圖2 流式細胞術檢測CD11c+群體中CFSE的熒光強度

2.2 莫諾苷對BMDCs表型的影響

如圖3，與對照組相比，莫諾苷組 BMDCs中CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子的表達明顯增加（P＜0.05和P＜0.01）；與脂多糖組相比，莫諾苷+脂多糖組 CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子的表達也明顯增加（P＜0.05和P＜0.01）。

圖3 莫諾苷對BMDCs表型的影響

2.3 莫諾苷對BMDCs分泌IL-6、IL-12的影響

如圖4，對于未成熟BMDCs來說，莫諾苷組與對照組相比，上清液IL-6含量明顯下降（P＜0.01），IL-12p70無明顯差異；對于成熟BMDCs來說，莫諾苷+脂多糖組與脂多糖組相比，上清液IL-6含量無明顯差異，而IL-12p70的分泌則顯著增多（P＜0.01）。

2.4 莫諾苷對BMDCs激活抗原特異性CD4+T細胞的活化、增殖和分化的影響

與脂多糖組相比，莫諾苷+脂多糖組CD69的表達無明顯差異，而CD25的表達明顯增加（P＜0.01）；莫諾苷+脂多糖組的BMDCs與T細胞共培養時，OTⅡ小鼠的CD4+T細胞大量增殖；莫諾苷+脂多糖組IFN-γ的表達明顯增加（P＜0.01）。見圖5。

圖4 莫諾苷對BMDCs分泌細胞因子的影響

圖5 莫諾苷對BMDCs激活抗原特異性CD4+T細胞的影響

3 討論

本研究結果表明，莫諾苷促進BMDCs的成熟，主要表現在莫諾苷可以增強BMDCs CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ類分子等關鍵表面標志物的表達，對T細胞活化的第一信號和第二信號起到放大作用；并且莫諾苷可以上調BMDCs分泌細胞因子IL-12的能力，進一步誘導T細胞增殖和分化，從而啟動完整的免疫應答；此外，莫諾苷還促進BMDCs激活抗原特異性CD4+T細胞的中期活化以及增殖水平，增強BMDCs的抗原提呈功能，促進CD4+T細胞向Th1分化。樹突狀細胞作為抗原提呈細胞，可以處理抗原并將其呈遞給T細胞，因此樹突狀細胞的激活和成熟對免疫應答具有關鍵影響。而莫諾苷可以促BMDCs的成熟，增強其抗原提呈功能，從而增強免疫應答，這為莫諾苷的應用提供了新的可能性。

已有文獻報道［8］，莫諾苷可以降低大鼠心肌中IL-6的表達。我們的實驗中，莫諾苷抑制未成熟的BMDCs IL-6的分泌，而在成熟的BMDCs中，IL-6的表達則不受莫諾苷刺激的影響，我們猜測可能由于體外脂多糖的作用大于莫諾苷的作用。目前未有文獻明確報道莫諾苷與IL-12的關系。在我們的研究中，成熟的BMDCs受莫諾苷刺激后分泌大量的IL-12。樹突狀細胞分泌大量IL-12可誘導初始T細胞（Th0）分化為Th1細胞，產生Th1型免疫應答。IL-12作為固有免疫和適應性免疫之間的關鍵分子，能夠驅動Th1細胞分化和擴增，同時抑制IL-4和拮抗Th2反應［9-12］。我們的實驗結果也證實了莫諾苷刺激BMDCs后，促進初始T細胞（Th0）向Th1分化。

NF-κB活化可導致促炎細胞因子、趨化因子、黏附分子、炎性受體和炎性酶如iNOS和COX-2的表達增強［13-15］，而莫諾苷可以抑制 NF-κB的活化，從而起到抗炎作用［16］。文獻報道，莫諾苷可以降低IL-6、IL-1β和TNF-α的水平，對急性心肌梗死后的大鼠具有抗炎作用［8］。然而，從免疫學角度出發，目前對莫諾苷的抗炎機制尚未有深入研究。本實驗結果顯示，BMDCs受到莫諾苷刺激后，高表達共刺激分子和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子，并且抗原提呈功能得到增強。但本實驗只檢測了BMDCs培養上清液中IL-6和IL-12的分泌，對TGF-β、IL-10等抑炎因子未進行檢測。綜上所述，莫諾苷在體外可促進BMDCs的成熟并增強其抗原提呈功能，并增強CD4+T細胞活化后向Th1分化，但莫諾苷介導樹突狀細胞調控T細胞分化的機制仍有待探究。