小窩蛋白-1對人甲狀腺上皮細胞增殖、凋亡及胞內活性氧水平的影響

劉寶翠，鄭婷婷，董利陽，牟笑，許鋮鋮，毛朝明

（江蘇大學附屬醫院核醫學科，江蘇鎮江212001）

橋本甲狀腺炎（Hashimoto′s thyroiditis，HT）是一種常見的器官特異性自身免疫性疾?。?］，是引發甲狀腺功能減退最常見的病因，甲狀腺濾泡組織結構的破壞和大量淋巴細胞的浸潤是其主要病理基礎［2-3］。小窩蛋白-1（Caveolin-1）是小窩的標志蛋白和主要蛋白成分［4］，與自身免疫性疾病的發生有一定相關性［5］。我們前期研究表明Caveolin-1在橋本甲狀腺炎的甲狀腺組織中呈現低表達［6］，提示Caveolin-1參與橋本甲狀腺炎的發病。本研究通過慢病毒轉染方式敲減甲狀腺上皮細胞Nthy-ori 3-1中的Caveolin-1基因，旨在探索Caveolin-1表達降低對甲狀腺上皮細胞增殖、凋亡及細胞內活性氧生成的影響，初步揭示Caveolin-1低表達對甲狀腺上皮細胞損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺上皮細胞株Nthy-ori 3-1（歐洲標準細胞收藏中心，ECACC）；人胚腎上皮細胞293T（中國科學院細胞庫）；兔抗β-肌動蛋白抗體、兔抗Caveolin-1抗體（美國 Cell Signaling Technology公司）；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（Santa Cruz公司）；RPMI 1640培養基、DMEM培養基、胎牛血清（Gibco公司）；牛血清白蛋白（上海生工生物工程技術服務有限公司）；總RNA提取試劑盒RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司）；2×含染料Taq預混PCR反應試劑（北京康潤誠業生物科技有限公司）；Caveolin-1 shRNA引物（蘇州吉瑪基因股份有限公司）；轉染試劑LipoFiterTM（漢恒生物科技上海有限公司）；嘌呤霉素、聚凝胺（Sigma公司）；慢病毒包膜質粒pMD2.G、包裝質粒psPAX2、shRNA慢病毒表達載體pLKO.1-嘌呤霉素（中國科學院上海生命科學研究院）；ECL發光液、全蛋白提取試劑盒、PVDF膜（美國Millipore公司）；MTT、活性氧檢測試劑盒（南通碧云天生物公司）；AnnexinV Alexa Fluor 647/PI凋亡檢測試劑盒（南京福麥斯生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 Nthy-ori 3-1細胞、293T細胞分別培養于含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI1640、DMEM培養基中，并于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養。

1.2.2 慢病毒包裝及感染 質粒轉染前1天將293T細胞接種至6孔板中，當細胞匯合度為60%時，將目的基因質粒sh Caveolin-1或空載pLKO.1與包膜質粒 pMD2.G、包裝質粒 psPAX2用 LipoFiterTM轉染試劑共轉入293T細胞中（目的質?；蚩蛰d∶pMD2.G∶psPAX2=4∶1∶3）。收集48 h的病毒液，加入提前接種在6孔板中的Nthy-ori3-1細胞中，同時加入聚凝胺以提高病毒感染細胞的效率。6～8 h后棄病毒液換成完全培養基，48 h后用5 mg·L-1嘌呤霉素2～3 d篩選出所需細胞，獲得sh-NC（空載質粒病毒感染）細胞和sh Caveolin-1（目的基因質粒病毒感染）細胞?？瞻讓φ战MNthy-ori 3-1細胞不做任何處理。

1.2.3 qRT-PCR檢測Caveolin-1 mRNA表達 取各組處于對數生長期的Nthy-ori 3-1細胞，用Trizol法提取總RNA。在37℃1 h、85℃15 s、4℃保存反應條件下，將RNA反轉錄為cDNA。采用SYBRGreen法進行 qRT-PCR。Caveolin-1上游：5′-TCAACCGCGACCCTAAACACC-3′，下游：5′-TGAAATAGCTCAGAAGAGACA-3′；GAPDH上游：5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′，下游：5′-GGGTGGAATCATATTGGAACA-3′。反應條件為正常兩步法，50℃2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，循環40次。以GAPDH作為內參，所得結果用2-ΔΔCt方法進行分析，實驗獨立重復3次。

1.2.4 蛋白質印跡檢測Caveolin-1蛋白表達 收集用0.25%胰酶消化后的各組Nthy-ori 3-1細胞，加入細胞裂解液于冰上裂解細胞30 min，12 000×g離心3 min后，吸取蛋白上清液，加入5×上樣緩沖液，混勻后100℃煮10 min后，每孔加5μg蛋白，10%SDS-PAGE分離膠進行蛋白電泳。60 mA恒流電泳至溴酚藍剛好跑出，低溫恒壓轉膜。用5%脫脂牛奶37℃封閉1 h，一抗（1∶1 000）4℃過夜，TBST洗膜（10 min×3次），用含HRP標記的山羊抗兔的二抗（1∶5 000）在37℃孵育1 h后，TBST洗膜（10 min×3次）后，ECL顯影。實驗獨立重復3次。

1.2.5 MTT法檢測Nthy-ori3-1細胞增殖 將各組Nthy-ori3-1細胞以3.5×103個/孔接種于96孔板中，每組設5個復孔，每孔加入200μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，置于37℃、5%CO2培養箱培養。24 h和48 h后，棄去上清液，每孔加入終濃度為0.5 g·L-1的MTT培養基100μL，孵育4 h。棄去上清液，每孔加入100μL DMSO振蕩5～10 min，使結晶充分溶解。用酶聯免疫分析儀（EXL800）測定490 nm波長各孔光密度（D）值。每組實驗重復3次，計算細胞增殖率，細胞增殖率（%）=D實驗組/D對照組×100%。

1.2.6 流式細胞術檢測Nthy-ori3-1細胞凋亡 細胞培養24 h后，用無EDTA的胰酶消化并收集，250×g離心5 min。用100μL緩存液懸浮細胞，加入5μL AnnexinV/Alexa Fluor 647和10μL的PI溶液，混勻室溫避光孵育15 min。孵育結束后，加400μL PBS混勻，流式細胞儀檢測分析。

1.2.7 熒光探針DCFH-DA檢測Nthy-ori 3-1細胞內活性氧水平 將各組細胞消化計數，以2×105個/孔加入6孔板中，培養過夜后，加入提前配制好的終濃度為10μmol·L-1的DCFH-DA探針，置于37℃、5%CO2的培養箱中避光孵育30 min。之后將細胞用胰酶進行消化，用不含胎牛血清的RPMI 1640重復洗滌3次。立即用流式細胞儀進行檢測。

1.3 統計學分析

應用Graphpad Prism 6.0軟件進行統計學分析，所有數據用均數±標準差（±s）表示，兩組間均數比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Caveolin-1慢病毒載體轉染Nthy-ori 3-1細胞的干擾效果驗證

Caveolin-1慢病毒載體轉染Nthy-ori 3-1細胞后，qRT-PCR和蛋白質印跡結果顯示，與sh-NC組相比，sh Caveolin-1組細胞中 Caveolin-1的mRNA（t=21.70，P＜0.01）和蛋白水平（t=12.21，P＜0.01）明顯下調；而sh-NC組與空白對照組間無明顯差異。這一結果提示Caveolin-1敲減穩轉細胞系構建成功。見圖1。

圖1 Caveolin-1慢病毒載體轉染Nthy-ori3-1細胞的干擾效果驗證

2.2 Caveolin-1敲減后Nthy-ori 3-1細胞增殖能力下降

MTT檢測結果顯示，與sh-NC組相比，sh Caveolin-1組 24 h（n=5；t=16.00，P＜0.01）和48 h（n=5；t=23.12，P＜0.01）的細胞增殖率均明顯降低；而sh-NC組與空白對照組間無明顯差異。見圖2。sh Caveolin-1組24 h和48 h間細胞增殖能力無明顯差異，故Caveolin-1敲減后最佳實驗時間選為24 h。

圖2 敲減Caveolin-1后Nthy-ori3-1細胞增殖率變化

2.3 Caveolin-1敲減后Nthy-ori3-1細胞凋亡增加

流式細胞術檢測結果顯示，與sh-NC組相比，sh Caveolin-1組細胞凋亡率明顯增加（n=3；t=12.09，P＜0.01）；而sh-NC組與空白對照組間無明顯差異。見圖3。

2.4 Caveolin-1敲減后Nthy-ori 3-1細胞內活性氧水平升高

用活性氧檢測探針DCFH-DA的平均熒光強度反映Nthy-ori 3-1細胞內活性氧的水平。流式細胞術檢測結果顯示，與sh-NC組相比，sh Caveolin-1組細胞內活性氧水平明顯增加（n=3；t=16.835，P＜0.01）；而sh-NC組與空白對照組間無明顯差異。見圖4。

3 討論

圖3 敲減Caveolin-1后Nthy-ori3-1細胞凋亡率變化

圖4 Caveolin-1敲減后Nthy-ori3-1細胞內活性氧水平變化

橋本甲狀腺炎的發病率僅次于毒性彌漫性甲狀腺腫（Graves?。?］，且患病率在我國以每年5%的速度升高。迄今為止，橋本甲狀腺炎的發病機制仍然不清楚，尚無針對病因的治療措施。Caveolin-1是一種細胞表面穴樣內陷中的主要膜蛋白，相對分子質量約為22 kDa，富含糖鞘脂和膽固醇［8］，參與癌癥、糖尿病、心血管疾病、系統性硬化病、肺纖維化等多種疾病的發生［9-12］。Caveolin-1在橋本甲狀腺炎的甲狀腺組織中呈現低表達［6，13］，提示Caveolin-1參與橋本甲狀腺炎的發病，然而其作用機制仍未完全清楚。

Caveolin-1定位于人染色體7q31.1，在上皮細胞、脂肪細胞、內皮細胞和成纖維細胞等一些終末細胞中含量豐富。Caveolin-1介導細胞內吞、膽固醇平衡、代謝轉化，影響心肌細胞、肝細胞等的增殖和凋亡［14-15］。已有研究表明，在橋本甲狀腺炎患者的甲狀腺組織中，caspase-3、caspase-6等凋亡蛋白的水平明顯高于正常甲狀腺組織［16-17］。而Caveolin-1低表達是否與甲狀腺上皮細胞凋亡有關，目前并不清楚。我們的研究結果顯示Caveolin-1敲減后Nthyori3-1細胞的增殖能力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，提示Caveolin-1異常低表達可能通過誘導甲狀腺上皮細胞的凋亡來參與橋本甲狀腺炎的發病，表明Caveolin-1可能是橋本甲狀腺炎治療的一個潛在靶點。

活性氧是細胞內多種氧化還原反應的正常代謝產物，主要是一些短暫存在的具有高度活性且分子量較小的含氧代謝物［18］。生理濃度的活性氧可以作為第二信使參與細胞多種信號分子的調節，介導不同生物反應如參與基因表達、轉錄，細胞的生長、分化以及細胞死亡等一系列生理過程，在決定細胞命運中起到極其重要的作用［19］。然而，過多活性氧的生成是引發炎癥反應的一種重要機制，甚至可以引發組織系統持續性炎癥反應［19-20］。在正常生理狀態下，甲狀腺上皮細胞產生適量水平的活性氧參與甲狀腺激素的合成［21］，但是高水平活性氧的產生則可誘發氧化應激從而導致甲狀腺上皮細胞的損傷，引發甲狀腺炎癥促進橋本甲狀腺炎的進展［19，22］。更為重要的是Kolypetri等［23］和本課題組［16］的研究發現活性氧可以誘導甲狀腺上皮細胞凋亡。本實驗結果顯示，在Caveolin-1敲減后Nthyori3-1細胞中活性氧的表達升高，提示Caveolin-1低表達可能通過促進Nthy-ori 3-1細胞中活性氧的積累進而導致甲狀腺上皮細胞凋亡的增加。

綜上所述，體外Caveolin-1敲減后甲狀腺上皮細胞增殖能力明顯下降，凋亡和活性氧水平明顯增加，提示甲狀腺上皮細胞內Caveolin-1異常降低可能是橋本甲狀腺炎發生、發展的重要原因，同時也提示Caveolin-1可能是橋本甲狀腺炎干預的潛在靶點。