17β-雌二醇促進大鼠坐骨神經橫斷性損傷修復

高建一，張磊，陳天琰，唐彬，李一鐳，李婧，胡嘉波

（江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013）

外周神經損傷后遠端軸突崩解發生Wallerian變性，殘存的雪旺細胞從損傷部位釋放并協同巨噬細胞共同清除髓鞘碎片，為軸突的再生清除障礙［1］。在修復后期，雪旺細胞重新增殖形成新的Büngner帶，引導軸突生長至靶器官并分泌神經營養因子滋養軸突，減少軸突凋亡［2-3］。神經再生修復是一個漫長且復雜的過程，到目前為止，臨床上仍沒有一種令人滿意的療法。研究發現，絕經后女性在使用雌激素治療后，其卒中的概率明顯下降［4-6］，證明雌激素可作用于除生殖系統外的其他系統，在中樞神經系統中可透過血腦屏障來抑制神經元凋亡［7-9］。雪旺細胞作為外周神經系統中最重要的神經膠質細胞，存在雌激素受體（estrogen receptor，ER）α（ER-α）和β（ER-β）。人體內生物活性最強的雌激素是 17β-雌二醇［10-11］，其不僅能夠通過受體配體結合途徑發揮作用，還能通過非受體依賴途徑保護細胞免受損害［12-13］。與此同時，17β-雌二醇還能延緩肌肉的萎縮并調節運動和感覺功能的恢復［14］。17β-雌二醇能夠加速外周神經損傷后神經的再生，但具體通過何種方式尚不清楚。本研究旨在觀察外源性17β-雌二醇在體外對雪旺細胞生物活性的影響，從而進一步觀察其在體內對大鼠坐骨神經橫斷性損傷的修復作用及其保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

12只雄性SD大鼠，200 g左右，由江蘇大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（蘇）2013-0011；將大鼠隨機分為17β-雌二醇組和對照組，每組6只。大鼠雪旺細胞RSC96細胞系購自上海恒圓生物科技公司；高糖DMEM、胎牛血清（美國Gibco公司）；17β-雌二醇（美國 Sigma公司）；CCK-8試劑盒（東仁化學科技有限公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；兔抗大鼠 ER-α/β一抗（萬類公司）；小鼠抗大鼠β-肌動蛋白一抗、兔抗小鼠HRP標記二抗（美國Santa Cruz公司）；羊抗兔HRP標記二抗（杭州聯科生物有限公司）；蛋白印跡系列設備（美國Bio-Rad公司）；實時熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司）；Trizol試劑（美國Thermo公司）；反轉錄試劑盒（大連TaKaRa公司）。

1.2 細胞實驗

1.2.1 17β-雌二醇溶液的配制 稱取0.054 4 g 17β-雌二醇，加入10 mL無水乙醇，混勻形成20 mmol/L的儲存液，再用無水乙醇稀釋成1 mmol/L的母液，儲存于-20℃。實驗時，取母液加入到無血清DMEM中，配成不同濃度的17β-雌二醇溶液。

1.2.2 CCK-8實驗檢測細胞增殖能力 將RSC96細胞按照10 000個/孔均勻接種于96孔板中，用含1%胎牛血清的DMEM在37℃、5%CO2條件下培養24 h，使細胞貼壁。隨后更換為含50、100、200、400 nmol/L 17β-雌二醇的無血清DMEM刺激24 h；按照試劑盒說明加入CCK-8試劑繼續孵育1 h；酶標儀檢測450 nm處光密度（D）值。選取最適濃度17β-雌二醇用于后續實驗。

1.2.3 細胞分組 將細胞分為2組：對照組和17β-雌二醇組。

1.2.4 蛋白印跡檢測雪旺細胞ER-α/β蛋白表達將RSC96細胞接種于6孔板中，當細胞生長至80%融合度時更換培養基為無血清DMEM，饑餓12 h。17β-雌二醇組加入含 100 nmol/L 17β-雌二醇的無血清DMEM，對照組更換為等量無血清DMEM，繼續刺激24 h。用RIPA裂解液提取總蛋白質；制備10%分離膠和濃縮膠并依照標準方法行SDSPAGE。70 V電泳30 min后加大電壓至110 V繼續電泳90 min完全分離條帶；300 mA濕轉120 min至PVDF膜；用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；將PVDF膜放入對應的一抗稀釋液中（兔抗大鼠 ER-α/β 1∶1 000，小鼠抗大鼠 β-肌動蛋白1∶500，TBST稀釋），4℃孵育過夜；次日 TBST洗膜3次，每次15 min；加入二抗（稀釋比均為1∶2 000）室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，每次15 min；最后在暗室曝光顯影。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞遷移能力 在Transwell上室中加入400μL含5 000個RSC96細胞的無血清DMEM，下室加入 600μL含或不含100 nmol/L 17β-雌二醇的10%胎牛血清DMEM，使細胞在37℃、5%CO2條件下遷移24 h；取出上室，PBS洗滌；4%低聚甲醛固定30 min；結晶紫染色10 min；PBS洗滌后用棉簽輕輕擦去小室內側的細胞，風干；在正置顯微鏡下隨機觀察5個視野，計數每個視野的細胞并取平均值。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞的傷口愈合能力 將RSC96細胞接種于24孔板，每孔50 000個細胞；當細胞均勻生長成單層后，用小號槍頭對每孔進行垂直劃痕，此刻記為0 h。立即更換為含或不含100 nmol/L 17β-雌二醇的無血清DMEM繼續培養24 h；用 Image J軟件測量并計算細胞相對遷移距離。

1.2.7 qRT-PCR檢測神經營養因子mRNA表達將RSC96細胞種于6孔板，當細胞生長至80%融合度時更換為無血清DMEM饑餓12 h；17β-雌二醇組加入含100 nmol/L 17β-雌二醇的無血清DMEM，對照組更換為等量無血清DMEM，繼續刺激12 h；用Trizol法提取總 RNA，反轉錄得到 cDNA。通過公式2-△△Ct計算mRNA相對表達強度。擴增反應程序：94℃預變性2min；95℃變性10 s；低于Tm值2～3℃退火30 s；72℃延伸30 s；行25～30個循環。引物序列及其產物長度見表1。

表1 基因引物序列

1.3 動物實驗

1.3.1 SD大鼠坐骨神經橫斷性損傷模型建立 術前禁食禁飲6 h，腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）完全麻醉大鼠，鈍性分離臀肌顯露右側坐骨神經。在距梨狀肌下緣3 mm左右切除神經3 mm，通過神經末端的收縮形成5 mm缺損距離。將兩側神經斷端塞入5 mm長的硅膠管（外徑2 mm，內徑0.7 mm）中，用9/0無創縫線固定，再用10/0手術線逐層縫合傷口，術后腹腔注射50 000 U青霉素預防感染。飼養環境保持在25℃左右，維持各12 h的明暗交替，動物可自由飲水和進食。17β-雌二醇組在術前1周每天腹腔給藥200μg/kg，對照組注射等量生理鹽水，術后每3天注射1次。

1.3.2 坐骨神經功能指數（SFI） 讓大鼠穩健通過一條100 cm×10 cm軌道盡頭的暗室中，行走前仔細在后肢上涂上無毒的手指泥，收集至少5個可測量的腳印。在第7、14、21、28天時分別收集17β-雌二醇組和對照組健側（N）、患側（E）的足印。計算公式：SFI=-38.3×（PLE-PLN）/PLN+109.5×（TSE-TSN）/TSN+13.3×（ITE-ITN）/ITN-8.8。其中，PL為足底全長，TS為第一至第五趾的距離，IT為第二、四趾間的距離。

SFI反映外周神經功能的恢復情況，分數-100表示功能完全喪失，而0表示神經功能正常。

1.3.3 水浴實驗 準備42℃恒溫水，從大鼠患側腳掌完全浸入水中開始計時，到大鼠腳掌掙扎出水結束計時，每只大鼠重復3次取平均值。

1.4 統計學分析

用GraphPad Prism 5.0軟件對所有數據進行統計學分析；實驗結果以均數±標準差（±s）表示；兩組間數據比較采用t檢驗；多組間數據比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。體外實驗每次設3個平行復孔，每組實驗至少重復3次。

2 結果

2.1 17β-雌二醇促進雪旺細胞增殖

CCK-8實驗表明，與0 nmol/L相比，50～200 nmol/L 17β-雌二醇能夠不同程度地促進雪旺細胞增殖（P均＜0.05）；其中100 nmol/L 17β-雌二醇刺激雪旺細胞增殖能力最強（t=5.236，P＜0.001）。見圖1。故選100 nmol/L 17β-雌二醇作為最適濃度進行后續實驗。

2.2 17β-雌二醇促進雪旺細胞ER表達

與對照組相比，17β-雌二醇組雪旺細胞 ER-α和ER-β表達明顯增加（ER-α：t=4.952，P＜0.01；ER-β：t=7.917，P＜0.01）。見圖2。

圖1 CCK-8實驗檢測雪旺細胞增殖能力

圖2 蛋白質印跡檢測兩組雪旺細胞ER-α和ER-β蛋白表達水平

2.3 17β-雌二醇促進雪旺細胞遷移

Transwell實驗顯示，用 100 nmol/L 17β-雌二醇刺激24 h后，17β-雌二醇組雪旺細胞遷移能力較對照組明顯增強（t=9.84，P＜0.001）。見圖3。

圖3 Transwell實驗檢測兩組細胞遷移能力

2.4 17β-雌二醇促進雪旺細胞傷口愈合

劃痕實驗結果顯示，100 nmol/L 17β-雌二醇刺激雪旺細胞24 h后，細胞損傷愈合距離較對照組明顯增加（t=5.049，P＜0.01）。見圖4。

圖4 劃痕實驗檢測兩組雪旺細胞傷口愈合能力

2.5 17β-雌二醇促進雪旺細胞多種神經營養因子mRNA表達

qRT-PCR檢測結果顯示，用100 nmol/L 17β-雌二醇刺激雪旺細胞12 h后，BDNF（t=2.925，P＜0.05）、CNTF（t=3.615，P＜0.01）、GDNF（t=2.719，P＜0.05）、NGF（t=2.857，P＜0.05）等 mRNA表達明顯升高。見圖5。

圖5 qRT-PCR分析兩組雪旺細胞內多種神經營養因子m RNA相對表達量

2.6 大鼠坐骨神經橫斷性損傷模型的建立

坐骨神經橫斷性損傷后第1天，大鼠患側腳趾張開困難，運動功能完全喪失，提示建模成功。見圖6。

圖6 大鼠坐骨神經橫斷性損傷模型建立

2.7 17β-雌二醇促進大鼠運動功能恢復

術后第7天，17β-雌二醇組大鼠SFI優于對照組（t=5.143，P＜0.01）。術后第28天，17β-雌二醇組大鼠運動功能恢復情況較對照組明顯提高（t=5.612，P＜0.01）。見圖7。

圖7 兩組大鼠坐骨神經功能指數比較

2.8 17β-雌二醇延緩腓腸肌萎縮

腓腸肌宏觀觀察和腓腸肌相對濕重共同顯示，17β-雌二醇組大鼠腓腸肌萎縮程度明顯小于對照組（t=3.441，P＜0.05）。見圖8。

圖8 兩組大鼠腓腸肌萎縮程度比較

2.9 17β-雌二醇促進大鼠感覺功能恢復

熱水浴實驗顯示，17β-雌二醇組大鼠對熱敏感性要遠高于對照組（t=9.707，P＜0.001），表明大鼠感覺功能恢復良好。見圖9。

圖9 水浴實驗比較兩組大鼠感覺功能恢復情況

3 討論

外周神經損傷如果治療不及時，長期缺失神經的靶器官會逐漸萎縮最終導致功能完全喪失甚至殘疾［15-16］。損傷再生需要多種細胞參與，其中雪旺細胞是參與修復最主要的神經膠質細胞。其在損傷后去分化成為一種“修復細胞”遷移至損傷部位并大量增殖，形成 Büngner帶引導軸突再生到靶器官［17-18］。目前對外周神經損傷的治療仍沒有一種理想的手段，但激素的運用在神經修復領域展現出新的潛能。

雌激素是體內常見的類固醇類激素，通過受體依賴和非受體依賴途徑發揮其生物功效。大量臨床實驗證明，中樞神經系統對雌激素十分敏感，外源性雌激素的治療對神經退行性疾病有明顯的保護作用［19-20］。不僅如此，腦組織還能上調ER的表達使其更有利于與配體結合，放大其保護作用，且這些保護作用可部分或完全被ER拮抗劑他莫昔芬所抑制［21］。除中樞神經系統外，雌激素在外周神經系統也能發揮一定的保護作用。外周神經系統中的某些細胞可同時表達ER和神經營養因子受體，因此雌激素與神經營養因子可發揮“共調節”作用［22-23］，將雌激素作為另一種神經營養因子激活不同的信號轉導通路，從而抑制細胞凋亡［24］。

本研究選擇雄性大鼠更好地排除了性別造成的內源性雌激素的干擾，并且通過腹腔注射給藥，有利于藥物的充分吸收，且操作方便、重復性強。體內實驗表明，雌激素在促進大鼠運功和感覺功能恢復的同時，還具有一定的抗炎作用。部分對照組大鼠在術后3 d出現自噬或者腳趾紅腫等炎癥反應，而17β-雌二醇組未出現該現象。可能是由于17β-雌二醇組術前1周的腹腔低劑量給藥，使大鼠體內維持了一定濃度的17β-雌二醇，其通過血運到達損傷部位調節局部炎癥反應，為損傷后的修復創造出一個相對溫和的微環境。在術后第28天，17β-雌二醇組SFI明顯優于對照組，但仍沒有恢復到術前的水平。這是由于坐骨神經橫斷性損傷完全恢復周期為3個月，考慮到損傷后4～14 d是再生的黃金時期，并決定最終的修復效果，因此早期應用雌激素加速恢復能夠為后期神經再生打下堅實的基礎［25］。

本研究結果表明，17β-雌二醇能夠促進雪旺細胞大量增殖并快速遷移，這些生物活性的改變有利于其更好地參與神經損傷后的修復。雪旺細胞分泌的膠質細胞源性神經營養因子對軸突的再生非常重要，能夠促進軸突與靶器官的連接，從而加快損傷后運動和感覺功能的恢復。但17β-雌二醇具體通過何種途徑調控雪旺細胞的生物活性以及抗炎與抗凋亡，具體機制還需要后期進一步研究。