人神經干細胞源施萬樣細胞微囊泡促進大鼠神經元軸突生長

葉開，余佳紅，陳天琰，高建一，張磊，胡嘉波

（江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013）

在周圍神經系統損傷中，神經元不可再生，軸突再生是神經功能恢復的基礎過程［1］。施萬細胞是周圍神經系統中的神經膠質細胞，沿著神經元軸突分布，參與周圍神經系統中神經纖維的構成，分泌多種神經營養因子以維持受損的神經元存活并促進軸突生長而達到外周神經再生的目的［2］。微囊泡是來源于親本細胞的微小膜性細胞器，其在細胞之間轉移胞質內容物，包括蛋白質、脂質和RNA等［3］。生長相關蛋白 43（growth associated protein 43，GAP43）是神經元發育和軸突再生過程中的一種重要蛋白質，參與神經突向外生長和神經元生長，對突起發育形成起重要調控作用［4］。施萬細胞微囊泡可能對神經再生，尤其是對軸突再生［5］具有重要意義，但臨床上人神經干細胞源施萬樣細胞（以下簡稱施萬樣細胞）來源受限［6］，且對軸突的再生作用尚不清楚。因此，本研究從SD大鼠乳鼠提取背根神經節（dorsal root ganglion，DRG），試用施萬樣細胞分泌的微囊泡刺激DRG神經元及神經元樣N2a細胞株，觀察施萬樣細胞微囊泡對神經軸突生長及GAP43 mRNA的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級SD雄性大鼠1只，出生4～5 d，由江蘇大學動物實驗中心提供，合格證號：201822045。N2a細胞系購于中國科學院干細胞庫；人源神經干細胞由課題組先前實驗所得［7］。

DMEM（美國Gibco公司）；DRG神經元培養基：Neurohasal培養基+2%B27添加劑（美國Gibco公司）+100μg/L神經營養因子+2 mmol/L L-谷氨酰胺（美國Sigma公司）；抗有絲分裂DRG神經元培養基：DRG神經元培養基+10μmol·L-1阿糖胞苷（上海源葉公司）；施萬樣細胞誘導培養基：DMEM/F12+10%無微囊泡胎牛血清（4℃行100 000×g離心12 h獲得，美國Gibco公司）+5μg/L血小板衍生因子-BB+10μg/L重組人堿性成纖維細胞生長因子+200μg/LHeregulin-1β（HRG-1β）+5μmol/L弗斯可林（美國 PeproTech公司）；基質膠（美國Coring公司）；Ⅰ型膠原酶（上海源葉公司）；35μg/L全反式維甲酸、神經營養因子、胰酶、乙二胺四乙酸、細胞膜染劑PKH67試劑盒、牛血清白蛋白、曲拉通100（美國 Sigma公司）；S100β一抗（1∶50）、DAPI（武漢博士德公司）；βⅢ-微管蛋白一抗（1∶300，鎮江愛必夢生物技術公司）；BCA試劑盒（上海碧云天生物技術公司）；Cy3TM-熒光二抗（1∶500，美國Jackson ImmunoResearch公司）；過碘酸-雪夫染色試劑盒（上海太陽生物技術有限公司）；cDNA合成試劑盒（北京全式金生物公司）；熒光定量PCR試劑盒、熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；多維全景流式細胞儀（Flow Sight，美國 Merck Millipore公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；納米顆粒跟蹤分析儀（英國NanoSight公司）。

1.2 施萬樣細胞免疫熒光染色和N2a細胞培養

施萬樣細胞由人源神經干細胞誘導分化而來，參考Zheng等［8］方法。將人源神經干細胞培養于施萬樣細胞誘導培養基，37℃、5%CO2條件下誘導分化2周，獲得施萬樣細胞；行S100β免疫熒光染色：4%低聚甲醛固定細胞20 min；于37℃用2%牛血清白蛋白和0.1%曲拉通100透化封閉1 h；加入抗S100β，4℃孵育過夜；棄一抗，避光加入Cy3TM_熒光二抗，37℃溫育2 h；棄二抗，PBS沖洗3遍；加入DAPI常溫放置10min；甘油封片；用倒置熒光顯微鏡捕獲圖。

DMEM+10%胎牛血清培養基中維持N2a細胞狀態。

1.3 DRG神經元原代培養及純化

參考文獻［9］實驗方法，如圖1所示，從SD大鼠乳鼠脊髓與坐骨神經交界的膨大處摘取DRG，轉移至離心管，4℃900 r/min離心5 min；棄上清液，加入3 g/LⅠ型膠原酶2 mL，37℃孵育30 min；4℃900 r/min離心5 min；棄上清液，加入0.25%胰酶+乙二胺四乙酸2 mL，37℃孵育20 min；加入數滴胎牛血清終止消化，4℃ 900 r/min離心5 min；取沉淀，接種于預先已包被基質膠的培養皿，加入抗有絲分裂DRG神經元培養基純化48 h；更換為DRG神經元培養基，每3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

圖1 DRG原位觀察

1.4 微囊泡的分離及其納米顆粒跟蹤分析

參考Ji等［10］方法，將施萬樣細胞的條件培養基于4℃行2 000×g離心20 min，以除去細胞碎片和雜質；然后，4℃行100 000×g離心70 min；棄上清液，用PBS洗滌沉淀；以相同方式進行第2次超離心并重復2次；棄上清液，加入100μL PBS重懸沉淀。BCA法檢測施萬樣細胞微囊泡的蛋白質含量（濃度為1 mg·mL-1）。將微囊泡注入儀器樣品室并通過納米顆粒跟蹤分析軟件分析（Version 2.3 Build 0006 BETA2）。

1.5 DRG神經元βⅢ-微管蛋白檢測

取“1.3”中DRG神經元，分2組，PBS組：加40μL PBS，用DRG神經元培養基補至2 mL；微囊泡組：加1 mg·mL-1施萬樣細胞微囊泡40μL，用DRG神經元培養基補至2 mL（終濃度：20μg/mL）；37℃、5%CO2條件下培養36 h；行βⅢ-微管蛋白免疫熒光染色（方法同“1.2”），倒置顯微鏡下獲取圖像，Image J 1.48軟件計算軸突長度。

1.6 熒光定量PCR檢測N2a細胞GAP43 mRNA表達水平

計數1×105個N2a細胞，接種于6孔板，撤離血清饑餓12 h；分別加入1 mg/mL施萬樣細胞微囊泡 0、10、40、80μL，用 Neurohasal培養基+20 ng/L神經營養因子補齊至2 mL（終濃度為0、5、20、40 mg/L），每組設3個復孔，刺激19 h；按照RNA提取步驟提取N2a細胞RNA，DNA酶處理后以25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min反轉錄合成cDNA。取2μL cDNA以20μL體系進行擴增，反應條件為95℃初始酶活化2 min，95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40個擴增循環。以GAPDH為內參基因，計算每個樣品的2-△△Ct，獲得相對表達強度，每次實驗取3次平均值。相關特異性引物見表1。

表1 寡核苷酸引物序列

1.7 施萬樣細胞微囊泡PKH67標記和檢測

將20μL施萬樣細胞微囊泡與PKH67染料按試劑說明書溶于1 000μL PBS，37℃溫育30 min；加1%牛血清白蛋白溶液終止反應，4℃行10 000×g離心70 min；棄上清液，PBS清洗2～3遍。PKH67標記的施萬樣細胞微囊泡與N2a細胞孵育48 h；PBS洗滌3遍，流式細胞儀檢測N2a細胞內熒光表達情況。

1.8 N2a細胞過碘酸-雪夫染色

計數1×105個N2a細胞，接種于6孔板，撤離血清饑餓12 h；分別加入1 mg/mL施萬樣細胞微囊泡0、40、80μL，用Neurohasal培養基+20 ng/L神經營養因子補齊至 2 mL（終濃度為0、20、40 mg/L），每組設3個復孔，刺激48 h；行過碘酸-雪夫染色：固定液固定10min；PBS沖洗3遍；滴加試劑A（過碘酸溶液）覆蓋培養皿底部即可、避光室溫放置5～8 min；PBS沖洗3遍；滴加等量試劑B（品紅醛），避光室溫放置10～20 min；PBS沖洗3遍；滴加等量試劑 C（蘇木素染色液），染色1～2 min；滴加等量試劑D（酸性乙醇分化液）2～3 s；PBS沖洗3遍，直至液體顏色變淺；75%乙醇脫色至無色。倒置顯微鏡下觀察細胞染色及形態，并獲取圖像，Image J 1.48軟件計算N2a細胞突起長度。突起增長率：（刺激后細胞突起長度-刺激前細胞突起長度）/刺激前細胞突起長度×100%；細胞陽性率：陽性細胞數/細胞總數×100%（每組計數50個細胞）。

1.9 統計學分析

實驗數據應用SPSS 17.0軟件統計分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組數據比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 施萬樣細胞形態及DRG神經元的生長

倒置顯微鏡下觀察顯示，施萬樣細胞呈現典型兩極或三極梭狀，S100β免疫熒光染色呈陽性；DRG神經元12 h內貼壁，用DRG神經元培養基培養3 d后，可見大量軸突從神經元團塊中延伸出，見圖2。

圖2 施萬樣細胞S100β染色和DRG神經元生長狀態（×40）

2.2 微囊泡的形態及粒徑分析

在納米顆粒跟蹤分析系統下，施萬樣細胞微囊泡的形態為不同大小的粒子，其直徑分布為50～1 000 nm范圍內，其中以100～300 nm居多，見圖3。

2.3 微囊泡促進DRG神經元βⅢ-微管蛋白表達

免疫熒光染色結果表明，DRG神經元軸突的βⅢ-微管蛋白表達陽性，與PBS組比較，施萬樣細胞微囊泡作用后的DRG神經元新生軸突長度明顯增加（t=9.794，P＜0.05）。見圖4。

2.4 微囊泡上調N2a細胞GAP43表達

與0 mg/L組相比，5 mg/L組GAP43 mRNA差異無統計學意義（q=0.700 3，P＞0.05），20 mg/L組及40 mg/L組GAP43 mRNA表達明顯增加（q=5.374，16.820，P均＜0.05），且呈一定的濃度依賴效應。見圖5。

圖3 施萬樣細胞微囊泡的形態及粒徑分析

圖4 DRG神經元βⅢ-微管蛋白免疫熒光染色（×40）

圖5 qRT-PCR檢測各組N2a細胞GAP43 mRNA的表達

2.5 N2a細胞吞噬微囊泡

PKH67標記的施萬樣細胞微囊泡與N2a細胞孵育后，在N2a細胞胞體中可見PKH67綠色熒光。見圖6。

圖6 流式細胞儀檢測N2a細胞內熒光

2.6 微囊泡促進N2a細胞突起生長及糖原生成

與0 mg/L組相比，20、40 mg/L組 N2a細胞突起增長率均明顯增加（q=5.229，17.580，P均＜0.05），其過碘酸-雪夫染色后的陽性細胞也隨之明顯增多（q=5.666，20.10，P均＜0.05）。見圖7和圖8。

圖7 各組N2a細胞過碘酸-雪夫染色（×200）

3 討論

大量證據表明，神經膠質細胞通過不同的細胞間通訊機制支持軸突再生，除了細胞間信號傳導的經典機制外，通過細胞外微囊泡的細胞間通訊已成為一種新的形式［11］。人神經干細胞的微囊泡對坐骨神經的修復有促進作用。施萬細胞是外周神經系統中主要的神經膠質細胞，與神經元生長發育緊密聯系［12］。本實驗表明，人神經干細胞源施萬細胞通過分泌微囊泡對神經的再生，尤其是神經元軸突的再生有促進作用。

圖8 各組N2a細胞突起增長率和過碘酸-雪夫染色細胞陽性率比較

我們的前期實驗參考Zheng等［8］方法已成功獲取施萬樣細胞，其具有傳統施萬細胞的形態特征，并在體外可至少存活18代；S100β蛋白是主要存在于外周神經系統施萬細胞中的特異性蛋白質［13］。結果顯示，S100β蛋白在施萬樣細胞中幾乎均為陽性，并表達施萬細胞多種特異性蛋白（數據未顯示）。

DRG主要由周圍神經系統感覺神經元構成，結構簡單經典，廣泛應用于神經組織工程、干細胞治療等方面［14］。DRG的取材來自于各個年齡段的大鼠，包括胎鼠、乳鼠及成年大鼠。成年大鼠的DRG神經元相對成熟且活性較低，胎鼠取材難度相對較大且耗時長。考慮實驗的可行性和方便性，我們采用方便操作、DRG活性較高的出生4～5 d乳鼠作為實驗對象，取材過程在4℃、30 min內完成，保證DRG神經元在體外的活性［15］。βⅢ-微管蛋白是神經元發育和軸突再生過程中的特異性骨架蛋白，通過檢測其表達可觀測神經元軸突的生長和再生情況［16］。由于軸突密度數量較大，難以實現定量統計，而本研究免疫熒光結果可鑒定體外培養的DRG神經元，同時對軸突的平均長度進行定量分析，施萬樣細胞微囊泡刺激后的DRG神經元軸突長度更長，說明施萬樣細胞微囊泡可促進軸突生長。

神經元細胞原代培養的影響因素諸多，例如，不同批次的大鼠DRG的活性，取材手法的差異等，都是實驗研究的不穩定因素。因此，以神經元樣細胞株N2a為對象進行后續實驗，同時也證明N2a神經元胞體及軸突可吞噬內化微囊泡［17］。本研究結果顯示，施萬樣細胞微囊泡同樣可以進入神經元樣N2a細胞內，由于細胞膜染料PKH67熒光信號的檢測會有放散效果，所以熒光信號的形狀大小并不能完全代表微囊泡的實際大小，可基本判斷N2a細胞中的綠色熒光即為PKH67標記的施萬樣細胞微囊泡。施萬樣細胞微囊泡刺激N2a細胞19 h時，N2a細胞GAP43 mRNA表達量明顯增加。施萬樣細胞微囊泡濃度在5 mg/L時未促進N2a細胞GAP43 mRNA表達增加，而濃度為20、40 mg/L時促進GAP43 mRNA表達增加，由此說明低濃度微囊泡可能對N2a細胞突起的形成無明顯效果，故后續N2a細胞突起形成實驗和過碘酸-雪夫染色中，微囊泡濃度均用 0、20、40 mg/L。過碘酸-雪夫染色用于檢測細胞內糖原［18］。本實驗N2a細胞的過碘酸 雪夫染色結果表明，施萬樣細胞微囊泡可促進N2a細胞內糖原生成。糖原代謝對神經元的發育過程起重要作用，糖原在神經系統中用于產生乳酸，在神經系統受損期間維持神經元存活及神經修復［19］。現已證明施萬細胞的微囊泡可作為載體，降低軸突生長錐中GTP酶RhoA活性，促進神經損傷后的軸突再生［4］。本實驗證實人源的施萬樣細胞微囊泡促進軸突生長的同時，也可促進神經元內糖原的生成，而神經元的糖原代謝與軸突生長間的具體聯系尚不清楚，以及施萬樣細胞微囊泡是否通過促進神經元的糖原代謝而促進軸突再生，還有待進一步研究。