白假絲酵母菌基因分型技術(shù)的研究

羅丹丹 湯文杰 祁文瑾

摘要：白假絲酵母菌是假絲酵母菌性外陰陰道病最常見的致病菌種。對(duì)致病菌快速準(zhǔn)確地分型在研究其所致的感染性疾病的發(fā)病機(jī)制及診治措施中發(fā)揮重要作用，并且有利于致病菌的流行病學(xué)調(diào)查。因此本文就用于白假絲酵母菌研究的基因分型技術(shù)作一綜述。

關(guān)鍵詞：真菌;白假絲酵母菌;基因分型

中圖分類號(hào)：R379? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.13.009

文章編號(hào)：1006-1959（2019）13-0025-04

Abstract：Candida albicans is the most common pathogenic strain of Candida vulvovaginal disease. The rapid and accurate classification of pathogenic bacteria plays an important role in the study of the pathogenesis and diagnosis and treatment of infectious diseases caused by it， and is conducive to the epidemiological investigation of pathogenic bacteria. Therefore， this paper reviews the genotyping techniques used for Candida albicans research.

Key words：Fungi;Candida albicans;Genotyping

假絲酵母菌性外陰陰道病（vulvovaginal candidiasis，VVC）是一種常見的女性生殖器感染性疾病，將近3/4的健康女性在其一生中至少經(jīng)歷過一次該疾病，其中約有5%～10%的女性經(jīng)歷了疾病的反復(fù)發(fā)作[1];白假絲酵母菌是本病最常見的致病菌種[2]。在微生物感染的研究及診治過程中，只有明確了病原菌的類型，弄清其感染方式及致病機(jī)理，才能采取有效的防控措施，因此首先需要對(duì)病原菌進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的分型。假絲酵母菌的傳統(tǒng)分型方法主要是根據(jù)假絲酵母菌的表型特征進(jìn)行分類，包括形態(tài)學(xué)分型、藥敏分型和血清學(xué)分型等。但上述分型方法的分型結(jié)果很容易因?yàn)榇郎y(cè)菌的生長(zhǎng)條件發(fā)生改變而不同，這就導(dǎo)致其識(shí)別力及重復(fù)性不高，因而在一定程度上限制了它們?cè)诓≡难芯考傲餍胁W(xué)調(diào)查過程中的運(yùn)用[3]。

傳統(tǒng)分型方法因其自身特點(diǎn)在假絲酵母菌分類學(xué)中依然扮演著重要角色，但隨著假絲酵母菌新種不斷被發(fā)現(xiàn)以及研究工作對(duì)菌種分型的要求提高，對(duì)病原菌的分類就不能僅限于種間水平，還必須深入到亞種，以便能對(duì)其進(jìn)行更精確的研究。白假絲酵母菌亦是如此，只有對(duì)其進(jìn)行更加深入的分型才能更好地了解其相關(guān)的致病機(jī)制。有越來越多的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同基因型的VVC致病白假絲酵母菌在抗真菌藥物敏感性以及毒力等方面存在著明顯差異[4-7]。因此，為了更好地研究白假絲酵母菌的基因多態(tài)性與其致病機(jī)制之間的相關(guān)性，迫切需要一種具有操作簡(jiǎn)單、分型快速、重復(fù)性強(qiáng)及分辨率高等特點(diǎn)，并且在臨床及實(shí)驗(yàn)室間易于推廣使用的假絲酵母菌基因分型方法。本文將對(duì)常用于白假絲酵母菌基因分型的方法作一綜述。

1多位點(diǎn)酶電泳分型

多位點(diǎn)酶電泳（multilocus enzyme electrophoresis，MLEE）是選取待測(cè)菌的多個(gè)特定酶蛋白，對(duì)其染色后再進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)蛋白的遷移率來判斷菌株之間的差異。蛋白的遷移率受其分子量大小及其所帶電荷的影響，酶蛋白遷移率的變化反映了其氨基酸序列的差異，由此可推斷編碼酶蛋白的DNA序列也存在差異。因此，可根據(jù)待測(cè)菌株的酶蛋白遷移率不同對(duì)其進(jìn)行基因分型。MLEE的分辨力普通但重復(fù)性很好，甚至擁有比許多基于DNA的基因分型技術(shù)更好的可重復(fù)性。但MLEE至少需評(píng)估10個(gè)酶才能有效地分辨菌株間的差異，因此操作耗時(shí)較長(zhǎng)。MLEE的主要缺點(diǎn)是它間接地檢測(cè)基因組并且評(píng)估的是物種中非常緩慢積累的變異。此外，MLEE不能檢測(cè)菌株之間基因水平的所有差異，因?yàn)閴A基的變化不一定導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨基酸發(fā)生變化。MLEE是第一種能夠有效分析白假絲酵母菌種群遺傳多態(tài)性的技術(shù)，但近年來MLEE正在被基于DNA的更具分辨力的基因分型方法所取代[8]。有學(xué)者使用MLEE對(duì)分離于VVC患者的白假絲酵母菌進(jìn)行分型，證實(shí)了MLEE具有較好的可重復(fù)性及分辨力[9]。Boriollo MF等[10]建議將MLEE聯(lián)合其他分子分型技術(shù)使用，能夠更加準(zhǔn)確地對(duì)菌株的種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分型

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)以隨機(jī)排列的寡核苷酸單鏈（通常不超過10 bp）為引物擴(kuò)增基因組DNA，引物隨機(jī)結(jié)合靶DNA，導(dǎo)致未知的序列片段被擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳分離，再經(jīng)染色或放射自顯影后觀察待測(cè)DNA條帶的數(shù)量和位置。RAPD擁有許多優(yōu)點(diǎn)，比如操作簡(jiǎn)單、快速以及成本低，并且不需要任何待測(cè)DNA的序列信息[11]。雖然RAPD的分辨率一般，但可以通過增加寡核苷酸引物的數(shù)量，顯著提高其分辨能力。Ying C等[12]用RAPD技術(shù)對(duì)分離于VVC患者的115株致病白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型，顯示出該方法具有較強(qiáng)的分型能力，可以很好地應(yīng)用于白假絲酵母菌的流行病學(xué)研究。盡管RAPD分型技術(shù)已成功用于多項(xiàng)臨床研究，但其卻存在著重復(fù)性差的缺點(diǎn)，該問題不僅可能發(fā)生在實(shí)驗(yàn)室之間，也可能發(fā)生在實(shí)驗(yàn)室內(nèi);實(shí)驗(yàn)中的任何操作、相關(guān)試劑的用量以及人為因素等都可能會(huì)影響擴(kuò)增的結(jié)果。此外，RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度較低，通常為35℃～40℃，易出現(xiàn)假帶。采用RAPD進(jìn)行基因分型時(shí)常會(huì)出現(xiàn)較為復(fù)雜的條帶圖，此時(shí)如果利用相關(guān)的計(jì)算機(jī)軟件可以有效地降低人工分析時(shí)出現(xiàn)的視覺誤差。只有建立一致而穩(wěn)定的優(yōu)化體系和擴(kuò)增條件，才能獲得較穩(wěn)定的試驗(yàn)結(jié)果，才有可能使RAPD技術(shù)的分型結(jié)果在不同實(shí)驗(yàn)室之間具有可比性。

3基于25S rDNA序列的分型

此基因分型技術(shù)是先提取待測(cè)菌株的基因組DNA，同時(shí)根據(jù)白假絲酵母菌基因組內(nèi)的25S rDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，然后運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳后于紫外燈下觀察，根據(jù)條帶的位置進(jìn)行分型。該技術(shù)使用的引物被設(shè)計(jì)跨越了25S rRNA基因（rDNA）可轉(zhuǎn)座Ⅰ型內(nèi)含子位點(diǎn)的區(qū)域[13];根據(jù)PCR產(chǎn)物分子量的大小將假絲酵母菌分為五種基因型：A基因型（450 bp，沒有內(nèi)含子）;B基因型（840 bp）;C基因型（450 bp和840 bp）：可看作是菌株在從A基因型到B基因型或B基因型到A基因型的轉(zhuǎn)變期間出現(xiàn)的中間形態(tài)，或者是A基因型和B基因型有性生殖的結(jié)果;D基因型（1080 bp）：為都柏林假絲酵母菌，其表型與白假絲酵母菌相似;基因型E（1400 bp）：分離自免疫缺陷患者[14]。

目前認(rèn)為這種以內(nèi)含子為基礎(chǔ)的PCR基因分型技術(shù)是研究白假絲酵母菌流行病學(xué)和分類學(xué)簡(jiǎn)單可行的方法[15]。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者都開始運(yùn)用此方法研究白假絲酵母菌基因型與其致病力及藥物敏感性間的相關(guān)性[4，15-19]。Zhang X等[18]用該方法對(duì)876株VVC致病白假絲酵母菌進(jìn)行分型，研究不同基因型白假絲酵母菌的抗真菌藥物敏感性差異，結(jié)果提示白假絲酵母菌25SrDNA中可轉(zhuǎn)座Ⅰ型內(nèi)含子的存在可能對(duì)影響伊曲康唑、氟康唑和制霉菌素的敏感性具有重要意義。該基因分型方法簡(jiǎn)單且重復(fù)性很好，但它的分辨率較低，使其在流行病學(xué)研究中受到限制;Dalvand A等[20]通過將此方法聯(lián)合基于ALT序列的PCR技術(shù)，很好地提高了分辨率。

4重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)分型

重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)（repetitive sequence-based PCR，REP-PCR）分型技術(shù)是針對(duì)目的基因非編碼區(qū)高度保守的重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，然后對(duì)特定序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對(duì)PCR產(chǎn)物電泳圖譜的分析，比較菌株間基因組存在的差異，是一種基因組指紋分析方法。REP-PCR技術(shù)是一種簡(jiǎn)單快速、靈敏可靠且低成本的方法，可用于大量樣品[21]，并且普遍運(yùn)用于臨床病原菌的分型中。但是，REP-PCR技術(shù)的重復(fù)性受很多因素的影響，如實(shí)驗(yàn)過程中使用的試劑和儀器以及人為操作因素等。基于REP-PCR原理的Diversi Lab[22]自動(dòng)化分型系統(tǒng)近年來被逐漸運(yùn)用，其為完成不同菌株之間的同源性分析提供標(biāo)準(zhǔn)化的、可重復(fù)的DNA指紋圖譜，從核酸提取到獲取分析報(bào)告僅需約4 h，操作步驟簡(jiǎn)便，并且使REP-PCR分型結(jié)果更精確，使不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果具備了可比性。

5微衛(wèi)星長(zhǎng)度多態(tài)性分型

微衛(wèi)星序列是由2～6個(gè)核苷酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列。微衛(wèi)星長(zhǎng)度多態(tài)性（microsatellite length polymorphic，MLP）根據(jù)微衛(wèi)星區(qū)側(cè)翼的單一序列設(shè)計(jì)引物，用熒光標(biāo)記的引物對(duì)微衛(wèi)星序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后再對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)微衛(wèi)星基序重復(fù)數(shù)目的差異進(jìn)行基因分型。MLP是白假絲酵母菌基因分型中分辨率最高的方法之一，然而其分辨率受所使用的微衛(wèi)星標(biāo)記影響，多個(gè)標(biāo)記組合分析可以更準(zhǔn)確地對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行分型，分辨率也更高[23]。我國(guó)學(xué)者運(yùn)用MLP技術(shù)對(duì)208株VVC致病白假絲酵母菌進(jìn)行分型，檢測(cè)到了51個(gè)基因型，結(jié)果顯示出致病菌獨(dú)特的基因型分布[24]。MLP還具有高通量、自動(dòng)化、重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)，但MLP的固有缺點(diǎn)包括專用設(shè)備的高成本和在常規(guī)使用中實(shí)施該技術(shù)的困難，特別是在發(fā)展中國(guó)家。為克服這一困難，Li J等[25]聯(lián)合微衛(wèi)星標(biāo)記物CAI和單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行分型，分辨率可達(dá)0.993，同時(shí)是白假絲酵母菌快速菌株分型有效且經(jīng)濟(jì)的方法，易于推廣運(yùn)用。此外，MLP技術(shù)因?yàn)椴煌瑢?shí)驗(yàn)室之間使用的設(shè)備差異比較大，使其分型數(shù)據(jù)不便于互相交流;因此有學(xué)者開發(fā)了等位基因CDC3階梯，以促進(jìn)白假絲酵母菌MLP基因分型數(shù)據(jù)在不同實(shí)驗(yàn)室之間的交流[26]。

6多位點(diǎn)序列分型

多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）采用PCR技術(shù)擴(kuò)增多個(gè)管家基因的核苷酸序列，然后進(jìn)行DNA測(cè)序，通過分析管家基因序列的差異，對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行基因分型。Bougnoux ME等首先提出了白假絲酵母菌MLST的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法，并且創(chuàng)建了白假絲酵母菌的MLST數(shù)據(jù)庫（http：//calbicans.mlst.net/），用于積累和分析全球來源的白假絲酵母菌MLST數(shù)據(jù)[27]。用MLST對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行基因分型時(shí)，僅需對(duì)7個(gè)管家基因（AAT1a、ACC1、VPS13、MPIb、ADP1、SYA1和ZWF1b）進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，然后將測(cè)序結(jié)果直接輸入MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，即可得到分型結(jié)果——菌株的序列型（sequence type，ST） [27]，通過對(duì)比待測(cè)菌株的ST就能分析不同菌株間的差異及關(guān)聯(lián)。Wu K等[28]證實(shí)了MLST是研究白假絲酵母菌微進(jìn)化及流行病學(xué)調(diào)查的可靠技術(shù)。

與其他分型方法相比，MLST的主要優(yōu)勢(shì)在于建立了有大型全球公用數(shù)據(jù)庫的國(guó)際網(wǎng)站，序列數(shù)據(jù)可以在不同國(guó)家和地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室之間共享，通過因特網(wǎng)可以在世界范圍內(nèi)進(jìn)行假絲酵母菌的流行病學(xué)研究。并且MLST是目前白假絲酵母菌基因分型方法中分辨率最高的方法之一。但是MLST也存在一些不足，首先MLST的分辨力取決于管家基因的變異程度;其次，MLST分析需要進(jìn)行大量的核酸測(cè)序工作，成本過高，耗時(shí)較長(zhǎng)，這也是限制MLST技術(shù)廣泛推廣的一個(gè)因素。

綜上所述，不同的基因分型方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，因此在實(shí)際研究中應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮途唧w的條件選擇合適的方法，為確保得到更加客觀、準(zhǔn)確的鑒定和分型結(jié)果，可以嘗試聯(lián)合使用多種基因分型技術(shù)，并結(jié)合傳統(tǒng)的分型方法，同時(shí)借助計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析。通過基因分型可以準(zhǔn)確地顯示白假絲酵母菌菌株間的差異性及相似性，從而判斷其親緣性的遠(yuǎn)近，揭示疾病的傳染源，為研究病原菌的致病力及其對(duì)抗真菌藥物敏感性的差異和臨床感染性疾病的診治提供依據(jù)。

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收稿日期：2019-3-27;修回日期：2019-4-9

編輯/張建婷