厚樸酚納米晶體混懸劑的制備及質量評價Δ

鄒清，談唯，寧青，崔莉，范永春#

（1.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院藥學部中藥房，南京 210028；2.江蘇省中醫藥研究院，南京 210028）

厚樸酚是一種羥基化聯苯化合物，是從中藥厚樸的根和莖皮中分離出來的主要活性成分[1]。厚樸酚具有廣泛的生物學效應，如抗炎、抗中風、抗焦慮、抗抑郁和抗腫瘤等作用[2]。但是，厚樸酚易被氧化的特性是限制其保存、制劑和臨床應用的瓶頸，另外其較差的水溶性和極低的生物利用度，也阻礙了其新藥的開發[2]。因此，研制新的給藥系統以解決厚樸酚生物利用度低的問題，已經成為藥劑工作者的研究重點[3]。

近年來，納米技術作為一種新興的技術吸引了廣大科研工作者的關注，該技術是通過降低藥物粒徑至納米級來增加難溶性藥物的溶解度和溶出速度的制劑手段[4-5]。其中，納米晶體混懸劑就是一種被廣泛研究的納米制劑[6]。制備藥物納米晶體混懸劑的技術理論可靠、操作簡明、易于規模化生產，將難溶性藥物制備成納米晶體，可以顯著提高其溶解度和溶出度，進而增加其在體內的吸收，提高生物利用度[7]。據統計，目前已有16種納米晶體藥物產品投放市場[4]。

星點設計-效應面優化法（Central composite design-response surface methodology，CCD-RSM）是一種多元非線性擬合試驗設計的方法，通過非線性數學模型繪制效應面并優選試驗條件，能較好地保證試驗準確性，且分析各因素之間的相互作用，具有準確度較高、預測性較好、選擇范圍大、試驗次數少的優點[8-9]。

本文采用反溶劑沉淀法[10-11]制備厚樸酚納米晶體混懸劑（MAG-NS）以提高厚樸酚的溶解度和溶出速率，并通過星點設計-效應面法優化MAG-NS的制備工藝，并對優化后制備的MAG-NS進行質量評價，為MAG-NS的應用開發提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Alliance2695高效液相色譜儀，包括四元泵及自動進樣系統、2996二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；AT201十萬分之一天平、MT5百萬分之一天平（瑞士Mettler公司）；Milli-Q純水機（美國雙杰有限公司）；RCZ-8M智能溶出儀（天津市天大天發科技有限公司）；Nano-ZS粒徑分析儀（英國Malvern公司）；JEM-2100透射電子顯微鏡（日本Jeol公司）。

1.2 藥品與試劑

厚樸酚對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：B20498，純度：＞99.8%）；厚樸酚原料藥（南京景竹藥業有限公司，批號：JZ15031502，純度：98%）；泊洛沙姆407（北京風禮精求商貿有限責任公司，批號：WPAJ508B）；乙腈、甲醇為色譜純；水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 MAG-NS的制備

采用反溶劑沉淀法制備MAG-NS。稱取泊洛沙姆407適量于燒杯中，加入10 mL純水攪拌至全部溶解，形成水相。另稱取厚樸酚原料藥適量溶解于無水乙醇形成含藥有機相。室溫下，將有機相在磁力攪拌下注入水相中形成初懸液，通過旋轉蒸發除去乙醇，既得厚樸酚納米晶體混懸液。

2.2 厚樸酚的含量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（75∶25，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：290 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 厚樸酚對照品溶液的制備 精密稱取1.72 mg厚樸酚對照品于50 mL量瓶中，加甲醇溶解，制成質量濃度為34.40μg/mL的厚樸酚對照品貯備液。精密吸取上述對照品貯備液1、2、4、6、8、10 mL分別置于10 mL量瓶中，甲醇定容，即得質量濃度為3.44、6.88、13.76、20.64、27.52、34.40μg/mL的系列對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取40 mg泊洛沙姆407和10 mg厚樸酚原料藥，按“2.1”項下方法制備MAG-NS（厚樸酚質量濃度為2 mg/mL）。精密量取1 mL MAG-NS于100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻，取適量溶液于13 000 r/min下離心10 min后即得供試品溶液。

2.2.4 系統適用性試驗 取“2.2.2”“2.2.3”項下厚樸酚對照品溶液和供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果，供試品溶液色譜圖中厚樸酚在對照品溶液色譜圖相同的保留時間處有色譜峰出現，供試品溶液中其他成分對待測成分無干擾，理論板數按厚樸酚峰計＞5 000。高效液相色譜圖見圖1。

2.2.5 線性范圍考察 精密吸取“2.2.2”項下系列質量濃度的厚樸酚對照品溶液10μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，以厚樸酚質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），進行回歸分析。結果，厚樸酚的回歸方程為y＝1.61×107x－1.63×104（r＝0.999 9），檢測質量濃度線性范圍為3.44～34.40μg/mL。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2.6 檢測限與定量限考察 取“2.2.2”項下濃度為3.44 μg/mL的厚樸酚對照品溶液，倍比稀釋，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為3∶1時，得檢測限；當信噪比為10∶1時，得定量限。結果，厚樸酚的檢測限為0.028 7 μg/mL；定量限為0.057 3 μg/mL。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取質量濃度為13.76μg/mL的厚樸酚對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，厚樸酚峰面積的RSD為0.98%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液適量，分別于室溫條件下放置2、4、6、8、10、12 h，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果，厚樸酚峰面積的RSD為1.76%（n＝6），表明本方法在12 h內穩定性良好。

2.2.9 重復性試驗 按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算厚樸酚的含量。結果，供試品溶液中厚樸酚的含量為19.67μg/mL，厚樸酚含量的RSD為1.44%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取已知含量的MAG-NS，共6份，每份1 mL（厚樸酚的含量為2.015 mg），置于100 mL量瓶中，再精密加入2.130 mg厚樸酚對照品，按“2.2.3”項下方法制備樣品，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算回收率。結果，厚樸酚的平均加樣回收率為100.81%（RSD＝1.73%，n＝6）。回收率試驗結果見表1。

2.3 MAG-NS制備相關工藝參數的確定

參考相關文獻方法[12]，以制得的納米晶體混懸劑的外觀為指標，考察攪拌速度和有機相注入速度對MAG-NS制備工藝的影響，以確定MAG-NS制備中的固定工藝參數。

表1 回收率試驗結果Tab 1 Results of recovery tests

2.3.1 攪拌速度 磁力攪拌速度分別設置為低速（100 r/min）、中速（500 r/min）和高速（1 000 r/min），按“2.1”項下方法制備MAG-NS。結果，較低攪拌速度下無法成功制備MAG-NS，體系有沉淀生成；當增大攪拌速度后，制備的MAG-NS無沉淀析出，且體系澄清透明，因此選擇1 000 r/min為制備工藝中的攪拌速度。攪拌速度對MAG-NS外觀的影響結果見表2。

表2 攪拌速度對MAG-NS外觀的影響結果Tab 2 Results of effects of stirring speed on the appearance of MAG-NS

2.3.2 有機相注入速度 設置有機相注入速度分別為緩慢滴加（0.01 mL/s）和快速注入（0.5 mL/s），按“2.1”項下方法制備MAG-NS。結果，緩慢滴加有機相，無法成功制備MAG-NS，體系有沉淀生成，因此，選擇0.5 mL/s為制備工藝中的有機相注入速度。有機相注入速度對MAG-NS外觀的影響結果見表3。

表3 有機相注入速度對MAG-NS外觀的影響結果Tab 3 Results of effects of organic phase injection rate on the appearance of MAG-NS

2.4 MAG-NS制備工藝的單因素考察

以MAG-NS外觀、粒徑、多分散系數（PDI）為指標，分別考察了有機相與水相的體積比、泊洛沙姆407與MAG的質量比（輔-藥比）、厚樸酚濃度對MAG-NS的影響。

2.4.1 有機相與水相的體積比 固定攪拌速度為1 000 r/min，有機相注入速度為0.5 mL/s，水相體積為10 mL，厚樸酚濃度為1 mg/mL，輔-藥比為2∶1，考察有機相和水相的體積比分別為1∶20、1∶10、1∶5時對MAG-NS的外觀、粒徑和PDI的影響。結果，當有機相與水相的體積比為1∶20時，無法成功制備MAG-NS；有機相與水相的體積比越接近時，形成的晶體粒徑越小，且分布更均勻。有機相與水相的體積比對MAG-NS的影響結果見表4。

2.4.2 輔-藥比 固定攪拌速度為1 000 r/min，有機相注入速度為0.5 mL/s，有機相與水相的體積比為1∶5，厚樸酚濃度為1 mg/mL，分別考察輔-藥比為1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1時對MAG-NS外觀、粒徑、PDI的影響。結果，當輔藥比為1∶2和1∶1，無法成功制備MAG-NS。輔-藥比對MAG-NS的影響結果見表5。

表4 有機相與水相的體積比對MAG-NS的影響結果Tab 4 Results of effects of volume ratio of organic phase to aqueous phase on MAG-NS

表5 輔-藥比對MAG-NS的影響結果Tab 5 Results of effects of the mass ratio of excipient to drug on MAG-NS

2.4.3 厚樸酚濃度 固定攪拌速度為1 000 r/min，有機相注入速度為0.5 mL/s，有機相與水相的體積比為1∶5，輔-藥比為2∶1，分別考察厚樸酚濃度為1、2、3、4、5 mg/mL時對MAG-NS外觀、粒徑、PDI的影響。結果，當厚樸酚濃度為4、5 mg/mL時，無法成功制備MAG-NS；隨著厚樸酚濃度的增加，MAG-NS粒徑沒有明顯差異，PDI的分布趨向于變寬。厚樸酚濃度對MAG-NS的影響結果見表6。

表6 厚樸酚濃度對MAG-NS的影響結果Tab 6 Results of effects of the concentration of magnolol on MAG-NS

2.5 星點設計-效應面法優化制備工藝

2.5.1 試驗設計 根據單因素試驗考察結果，確定影響MAG-NS制備工藝的因素以及各因素所取的水平范圍。以粒徑和PDI為考察指標，考察有機相與水相的體積比（X1）、輔-藥比（X2）、厚樸酚濃度（X3）3個因素對MAG-NS制備工藝的影響。兩個指標的測定結果標準化為0～1之間的“歸一值”（OD），再求算幾何平均數的OD值，以粒徑和PDI的OD值為評價指標對制劑處方進行優化[13]。采用Hassan方法進行數學轉換求“歸一值”dn[dn＝（Ymax－Yn）/Ymax－Ymin），n＝1～20]，OD 值＝（d1n×d2n）1/2，其中d1為粒徑的OD值，d2為PDI的OD值，n＝1～20。根據星點設計的原理[14-15]，每個因素設置5水平，應用Design Expert 9軟件進行3因素5水平試驗設計，并按“2.1”項下方法制備MAG-NS。因素與水平見表7，試驗設計與結果見表8。

表7 因素與水平Tab 7 Factors and levels

表8 試驗設計與結果Tab 8 Design and results of experiments

2.5.2 模型擬合與方差分析 應用Design Expert 9軟件進行多元線性回歸，得回歸方程為OD＝0.87+0.031X1+0.25X2－0.13X3－0.012X1X2+0.016X1X3+0.16X2X3+0.013X12－0.14X22－0.17X32（R2＝0.997 7），方差分析見表9。

表9 方差分析Tab 9 Analysis of variance

由表9可知，失擬項P＞0.05，表明方程擬合度較好，模型具有極顯著性差異，預測性高；各因素對OD值均有顯著的影響。

2.5.3 效應面優化 根據所得回歸方程進行響應面分析，并采用Design Expert 9繪制有機相與水相的體積比、輔-藥比、厚樸酚濃度對OD值影響的三維效應面圖。結果，最終確定最優處方：有機相與水相的體積比為1∶5、輔-藥比為4∶1、厚樸酚濃度為2 mg/mL。各因素對總評OD值影響的三維效應面圖見圖2。

圖2 各因素對OD值影響的三維效應面圖Fig 2 Three-dimensional response surface plots of the effects of each factor on OD

2.5.4 驗證試驗 根據最優處方工藝平行制備3批樣品進行驗證試驗。結果，MAG-NS的平均OD為0.940 0（RSD＝0.08%），與預測值0.977 7的相對誤差為3.86%，表明所建模型預測性良好，試驗設計結果具有較高的可靠性。

2.6 MAG-NS的質量評價

2.6.1 粒徑與形態 采用動態光散射技術[16]測定MAG-NS的粒徑與分布。待測樣品先在室溫下平衡3 min后再進行測定，每個樣品平行測定3次。采用透射電子顯微鏡觀察MAG-NS的形態；取適量的MAG-NS滴在載樣銅網上，在紅外光燈下干燥后，轉移至透射電子顯微鏡觀察其形態。結果，MAG-NS的厚樸酚晶體為圓球狀、大小均勻、表面光滑，粒徑為（34.88±0.33）nm，多分散系數為0.032±0.001。MAG-NS的粒徑分布見圖3，MAG-NS的透射電鏡圖見圖4。

表3MAG-NS的粒徑分布Tab 3 Particle size distribution of MAG-NS

2.6.2 載藥量的測定 將厚樸酚納米晶體混懸液凍干[17]，精密稱取凍干后的粉末（質量記為W），加入一定體積的甲醇（記為V）充分溶解，13 000 r/min離心10 min，取上清液10μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，計算厚樸酚的濃度（記為C）。根據載藥量計算公式（載藥量＝CV/W）[18]測定載藥量，平行測定3次。結果，MAG-NS的載藥量為（17.83±0.92）%。

圖4MAG-NS的透射電鏡圖Fig 4 TEM photograph of MAG-NS

3 討論

納米晶體混懸劑是運用“top down”法或“bottom up”法將純藥物在液體介質中形成納米級晶體顆粒的膠狀分散體系[19]；整個體系中無需載體材料，納米級粒徑的純藥物晶體顆粒只需依靠穩定劑維持靜電效應及空間效應從而穩定地混懸于體系中[20]。與其他的納米制劑相比，納米晶體混懸劑具有其獨特的優點，其制備方法具有通用性、操作簡單，易于工業化大生產；另外納米晶體混懸液通過噴霧干燥、冷凍干燥和流化床干燥可進一步固化，制備成膠囊、片劑等固體劑型或凍干粉劑等注射劑型[4，7，12]。

本文用于制備MAG-NS的方法是反溶劑沉淀法。采用反溶劑沉淀法制備的納米晶體混懸劑的外觀及粒徑與制備工藝密切相關，受多種因素的影響，例如攪拌速度、有機相注入速度、有機相與水相的體積比、輔-藥比、藥物濃度等因素，均對其造成了較大影響，需要一一進行考察。較快的攪拌速度和有機相注入速度，可以確保有機相和水相之間以較快的速率混勻，滿足納米晶核快速生長且分散均勻的條件，使制備的納米晶體混懸劑粒徑小、分散性較好。因此，本文首先篩選出合適的攪拌速度和有機相注入速度作為后續優化試驗的固定制備工藝，然后通過星點設計-效應面法進行優化，建立了擬合度高、相關性好的數學模型，優化得出MAG-NS的制備工藝。

綜上所述，本研究成功優化了MAG-NS的制備工藝，所制MAG-NS質量符合要求，可為MAG-NS的進一步開發提供參考，也為MAG-NS的工業化生產提供技術支持，希望在此基礎上，繼續深入進行該制劑的藥動學研究，為厚樸酚在臨床上的應用提供可能性。