骨肉瘤患者3種基因多態性與大劑量甲氨蝶呤不良反應相關性的Meta分析Δ

宋再偉，劉爽，易湛苗，張恩瑤，趙榮生，3#

（1.北京大學第三醫院藥劑科，北京100191；2.北京大學藥學院藥事管理與臨床藥學系，北京 100191；3.北京大學醫學部藥物評價中心，北京 100191）

骨肉瘤是最常見的原發性惡性骨腫瘤，好發于兒童與青少年。目前骨肉瘤治療難度仍較高，臨床上多采用以外科治療為主、化療或其他治療為輔的治療方案[1]。對于骨肉瘤的化療方案，美國國家綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）、《骨腫瘤臨床實踐指南》[2]、歐洲腫瘤內科學會（European Sarcoma Network Working Group，ESMO）、《骨肉瘤診斷、治療和隨訪指南》[3]、《中國骨肉瘤臨床循證診療指南（2018）》[4]均推薦了大劑量甲氨蝶呤[High-dose methotrexate（HDMTX），靜脈注射，＞500 mg/m2[5]]作為一線化療藥物。在骨肉瘤化療方案中，HD-MTX在有效提高血藥濃度、改善療效的同時，其藥物不良反應發生率也相應增加，包括血液毒性、肝毒性、腎毒性和神經毒性等嚴重不良反應。HD-MTX不良反應存在較大的個體差異，可導致化療中斷、腫瘤復發，影響治療，因此受到廣泛關注[6]。

MTX是葉酸拮抗劑，其通過與細胞內二氫葉酸還原酶結合，競爭性地抑制二氫葉酸還原酶活性，阻斷二氫葉酸轉化為具有生物活性的四氫葉酸，進而發揮藥理作用。在甲氨蝶呤代謝途徑中，亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、還原性葉酸載體（RFC）、P-糖蛋白（P-gp）相關的基因多態性被廣泛研究[7-9]。MTHFR是細胞內葉酸代謝的關鍵酶，對MTX發揮藥理作用有重要意義，其基因常見多態是MTHFR C677T（rs1801133）/A1298C（rs1801131）[7]。RFC1/SLC19A1是轉運MTX進入細胞產生療效的重要載體，RFC1G80A（rs1051266）存在多態性[8]。P-gp是由多重耐藥基因（MDR1/ABCB1）編碼的外排蛋白，將MTX外排出細胞，其基因常見多態是MDR1C3435T（rs1045642）[9]。

目前，國內外對MTHFR C677T/A1298C、RFC1G80A、MDR1C3435T多態性與HD-MTX不良反應相關性的研究結論不一致，有研究[10]表明，MTHFR677CT/TT型可顯著增加中國人群的中重度口腔黏膜炎的發生風險，而比利時人群中未觀察到顯著相關性[11]。骨肉瘤患者中HD-MTX個體化用藥仍缺乏有效指導，但尚無系統評價綜合評估骨肉瘤患者中相關基因多態性對HD-MTX不良反應的影響。因此，本研究采用Meta分析的方法，系統評價MTHFR C677T/A1298C、RFC1G80A、MDR1C3435T對HD-MTX不良反應的影響，為骨肉瘤患者HD-MTX臨床用藥提供循證參考，為臨床決策提供循證依據，促進HD-MTX個體化用藥，最終改善骨肉瘤患者的臨床結局。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準

1.1.1 研究類型 國內外公開發表的隊列研究。

1.1.2 研究對象 接受HD-MTX化療的骨肉瘤患者，種族、性別、年齡不限。

1.1.3 暴露因素MTHFR C677T/A1298C、RFC1G80A、MDR1C3435T分別按照野生型與突變型分組。

1.1.4 結局指標 HD-MTX相關不良反應發生率，包括：①血液毒性與骨髓抑制發生率（a.白細胞減少發生率；b.粒細胞減少發生率；c.血小板減少發生率；d.血紅蛋白降低/貧血發生率），②肝毒性發生率，③腎毒性發生率，④口腔黏膜炎發生率，⑤消化道毒性發生率，⑥整體不良事件發生率。不良反應分級參照世界衛生組織（WHO）抗癌藥物毒副作用分級、美國國家癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）常見不良反應評價標準（Common terminology criteria for adverse events，CTCAE）5.0版或其他通用標準，分為輕、中度（G1-2）和重度（G3-4）。

1.1.5 排除標準 重復發表的文獻；樣本重復的文獻僅納入最新發表的文獻；聯系作者后仍無法獲取全文的文獻；結局指標為總生存期（Overall survival，OS）等有效性指標或原發疾病患病風險；未提供基因型分布或不符合哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）[12]的研究；數據有誤或缺失的研究。

結合調研結果及我校英語教學現狀，校企合作模式下大學英語教學改革應從以下幾個方面入手，即改革現有的高校英語教學模式，將英語知識與學生專業知識相融合，建立與專業相結合的大學公共英語教學模式將是未來教學改革的重要聚焦點。而且學校以結合市場為導向，注重學生英語實踐能力，更能培養出企業所需的高水平外語人才，實現校企合作“雙贏”。

1.2 檢索策略

計算機檢索Medline、Embase、中國知網、萬方數據和中國生物醫學文獻數據庫，補充檢索clinicaltrials.gov。檢索限定在題目或摘要中進行。英文數據庫以“Methotrexate”及其同義詞，“Osteosarcoma*”“Osteogenic sarcoma*”等大劑量甲氨蝶呤適應證，“Gene”“Polymorphim”“Methylenetetrahydrofolate reductase”“RFC1”“Pglycoprotein”“Multidrug resistance protein 1”等關鍵詞合并檢索。中文數據庫以“甲氨蝶呤”及其同義詞，“骨肉瘤”等大劑量甲氨蝶呤適應證，“基因”“多態性”“亞甲基四氫葉酸還原酶”“還原葉酸載體”“P-糖蛋白”等關鍵詞合并檢索。檢索時限均為建庫起至2018年3月。同時對納入文獻的參考文獻進行手工補充檢索。本項系統評價與Meta分析已在PROSPERO平臺（網址：http：//www.crd.york.ac.uk/PROSPERO/）注 冊 ，注 冊 號No.CRD42018096992。

1.3 資料提取與質量評價

1.3.1 資料提取 明確和統一文獻的納排標準后，按照題目、摘要和全文的逐級順序，由2名研究者獨立進行文獻篩選。完成文獻篩選后，2名研究者根據預先設計的資料提取表獨立提取納入文獻的基本信息，提取信息包括第一作者、發表年份、患者國家、種族或地區、性別比例、年齡、MTX劑量、基因位點、是否符合HWE平衡（χ2檢驗）、結局指標及不良反應定義等。若納入文獻中相關數據缺失，通過郵件形式聯系通信作者獲取數據。出現不一致時，通過討論或咨詢第三方協商解決。

1.3.2 質量評價 2名研究者獨立采用Cochrane協作網推薦的紐卡斯爾-渥太華量表（The Newcastle-Ottawa scale，NOS）[13]評價納入研究的偏倚風險。NOS量表共8個評價條目，滿分為9分，其中研究人群選擇方面4個條目、組間可比性方面1個條目、結果測量方面3個條目。7～9分為高質量研究，5～6分為中等質量研究，1～4分為低質量研究。如有異議，由第3方（通信作者）參與討論并解決分歧。

1.4 統計學方法

應用Microsoft Excel 2016軟件建立數據庫，雙人錄入并校對。對納入文獻的基因型分布頻率進行χ2檢驗，P＞0.05表明樣本符合HWE，說明樣本具有群體代表性。

首先判斷同一結局指標的研究間是否存在明顯臨床異質性，如納入人群疾病種類、不良反應定義是否相似。當2項或2項以上文獻報道了同一種結局指標且研究間沒有明顯臨床異質性時，采用Cochrane協作網提供的Rev Man 5.3統計軟件進行Meta分析。對于無法進行Meta分析的結局指標，進行描述性分析。Meta分析時，分析資料與方法如下：（1）統計學指標，采用比值比（Odds ratio，OR）及其95%置信區間（CI）評估基因多態性與HD-MTX不良反應的相關性；（2）遺傳模型，分別計算顯性遺傳模型（MM/Mmvs.mm）、隱性遺傳模型（MMvs.Mm/mm）、等位基因遺傳模型（Mvs.m）下的OR及95%CI，其中M為突變型，m為野生型；（3）效應量檢驗，用Z檢驗計算OR是否具有統計學意義（P＜0.05）；（4）統計學模型，所有分析均采用固定效應模型合并OR值；（5）異質性評估，用q檢驗及I2評價研究間的異質性大小，P異質性＞0.10或I2≤50%表明不存在顯著異質性，反之，P異質性≤0.10且I2＞50%表明異質性明顯[14]，則進一步分析異質性來源；（6）敏感性分析，逐篇剔除納入Meta分析的研究，觀察剔除的研究對合并效應量的影響，以判斷Meta分析的穩定性和可靠性；（7）亞組分析與異質性分析，當研究數量足夠時，按不同年齡和種族進行亞組分析，各研究結果存在統計學異質性時，首先排除數據提取錯誤，觀察亞組分析是否可以解釋異質性來源，并結合敏感性分析尋找異質性來源，若最終無法明確異質性來源，換用隨機效應模型，或行描述性分析；（8）發表偏倚，采用倒漏斗圖評估發表偏倚（研究數＞10時有效[15]）。

2 結果

2.1 納入研究基本信息

按照相應檢索式進行檢索，共檢出文獻1 901篇，手工補充納入文獻4篇，去重764篇，閱讀題目和摘要后去除1 129篇，去除研究類型不符合2篇、研究人群不符合1篇、未報道結局指標數據1篇，最終納入8篇（項）研究[10-11，16-21]，其中 4 項研究[10-11，17-18]納入 Meta分析、4 項研究[16，19-21]僅納入描述性分析，合計608例患者。8項納入研究中，3 項研究[10，17，19]對象為亞洲人群，5項研究[11，16，18，20-21]對象為高加索人群，4項研究[11，16-17，21]納入的患者為兒童，3 項研究[10，19-20]同時納入了兒童與成人，1 項研究[18]未報道患者年齡范圍。劑量方面，8項研究均嚴格限定為HD-MTX?；蚨鄳B性方面，研究MTHFR C677T、MTHFR A1298C、RFC1G80A、MDR1C3435T的研究數量分別為 6[10-11，17-19，21]、5[17-21]、4[16-18，21]、2[16，20]項。經過χ2檢驗，8項納入研究均符合HWE平衡。報道的結局指標包括血液毒性、肝毒性、腎毒性及口腔黏膜炎等不良反應，不良反應分級標準多為WHO標準或CTCAE。納入研究基本信息見表1。

表1 納入研究基本信息Tab 1 General information of included studies

2.2 方法學質量評價結果

表2 納入研究的方法學質量評價結果Tab 2 Methodological quality evaluation of included studies

2.3 MTHFR C677T多態性與HD-MTX不良反應的相關性分析

共 6項研究[10-11，17-19，21]評估了MTHFR C677T基因多態性與HD-MTX不良反應的相關性。對于肝毒性、腎毒性、口腔黏膜炎，相關性分析結果見表3。

2.3.1 肝毒性發生率 ①相關性。對于G1-4肝毒性發生率，單項研究提示MTHFR C677T多態性與G1-4肝毒性不存在顯著相關性。對于G1-2肝毒性發生率，3種遺傳模型下MTHFR C677T多態性與G3-4肝毒性[TT/CTvs.CC：OR＝2.02，95%CI（0.85，4.80）；TTvs.CT/CC：OR＝0.68，95%CI（0.21，2.18）；Tvs.C：OR＝1.27，95%CI（0.63，2.57）]均無顯著相關性。對于G3-4肝毒性發生率，3種遺傳模型下MTHFR C677T多態性與G3-4肝毒性[TT/CTvs.CC：OR＝0.50，95%CI（0.21，1.18）；TTvs.CT/CC：OR＝1.47，95%CI（0.46，4.69）；Tvs.C：OR＝0.79，95%CI（0.39，1.60）]均無顯著相關性。亞組分析結果表明，亞洲患兒與高加索患者間的差異不具有顯著性（P亞組＞0.05），MTHFR C677T與G1-2、G3-4肝毒性相關性的Meta分析森林圖見圖1、圖2。

②敏感性分析、異質性分析與發表偏倚分析。對肝毒性發生率的6個Meta分析結果進行敏感性分析。剔除Park JA等[17]的研究后，顯性遺傳模型下的兩項Meta分析合并效應量發生顯著改變，但其他遺傳模型下的Meta分析合并效應量均未發生顯著改變，整體穩定性與可靠性尚可。同時，肝毒性有關的Meta分析均不存在異質性，P異質性＞0.10、I2≤32%。由于Meta分析均只納入2項研究[17-18]，此時倒漏斗圖識別發表偏倚的敏感性較低，發表偏倚無法排除。

2.3.2 腎毒性發生率 ①相關性。對于G1-4腎毒性發生率，3種遺傳模型下，均有研究表明MTHFR C677T多態性與G1-4腎毒性發生風險有顯著相關性（P＜0.05）。對于G1-2腎毒性發生率，3種遺傳模型下MTHFR C677T多態性與G1-2腎毒性均無顯著相關性（P＞0.05）。對于G3-4腎毒性發生率，顯性遺傳模型下MTHFR C677T多態性與G3-4腎毒性有顯著相關性[TT/CTvs.CC：OR＝12.35，95%CI（3.28，46.42），P＜0.001]，MTHFR C677T與G3-4腎毒性相關性的Meta分析森林圖見圖3。

表3 MTHFR C677T基因多態性與肝毒性、腎毒性和口腔黏膜炎的相關性Tab 3 Association between MTHFR C677T gene polymorphism and hepatic toxicity，renal toxicity and oral mucositis

圖1 MTHFR C677T與G1-2肝毒性相關性的Meta分析森林圖（TT vs.CT/CC）Fig 1 Forest plot for Meta-analysis of association between MTHFR C677T and G1-2 hepatic toxicity（TT vs.CT/CC）

圖2 MTHFR C677T與G3-4肝毒性相關性的Meta分析森林圖（TT vs.CT/CC）Fig 2 Forest plot for Meta-analysis of association between MTHFR C677T and G3-4 hepatic toxicity（TT vs.CT/CC）

圖3 MTHFR C677T與G3-4腎毒性相關性的Meta分析森林圖（TT/CT vs.CC）Fig 3 Forest plot for Meta-analysis of association between MTHFR C677T and G3-4 renal toxicity（TT/CT vs.CC）

②敏感性分析、異質性分析與發表偏倚分析。對重度腎毒性發生率的3個Meta分析結果進行敏感性分析。由于Meta分析均只納入2項研究[10，17]，剔除任華益等[10]的研究后，3種遺傳模型下的Meta分析合并效應量量均發生顯著改變，提示Meta分析穩定性欠佳。此外，隱性遺傳模型下的Meta分析存在顯著異質性（P異質性＝0.04、I2＝77%），異質性可能源于患兒和混合人群間的顯著差異（P亞組＜0.05）。同時，發表偏倚仍無法排除。

2.3.3 口腔黏膜炎發生率 ①相關性。對于G1-4口腔黏膜炎發生率，3種遺傳模型下C677T多態性與G1-4口腔黏膜炎發生風險均存在顯著相關性，其中隱性遺傳模型（TTvs.CT/CC）的OR＝2.27，95%CI（1.20，4.27），P＝0.01，MTHFR C677T與口腔黏膜炎相關性的Meta分析森林圖見圖4。

圖4 MTHFR C677T與G1-4口腔黏膜炎相關性的Meta分析森林圖（TT vs.CT/CC）Fig 4 Forest plot for Meta-analysis of association between MTHFR C677T and G1-4 oral mucositis（TT vs.CT/CC）

對于G1-2口腔黏膜炎發生率，單項研究提示3種遺傳模型下C677T多態性與G1-2口腔黏膜炎均無顯著相關性（P＞0.05）。對于G3-4口腔黏膜炎發生率，C677T多態性與G3-4口腔黏膜炎有顯著相關性[TT/CTvs.CC：OR＝2.84，95%CI（1.25，6.45），P＝0.01；Tvs.C：OR＝2.04，95%CI（1.06，3.93），P＝0.03]，MTHFR C677T與重度口腔黏膜炎相關性的Meta分析森林圖見圖5、圖6。

圖5 MTHFR C677T與G3-4口腔黏膜炎相關性的Meta分析森林圖（TT/CT vs.CC）Fig 5 Forest plot for Meta-analysis of association between MTHFR C677T and G3-4 oral mucositis（TT/CT vs.CC）

圖6 MTHFR C677T與G3-4口腔黏膜炎相關性的Meta分析森林圖（T vs.C）Fig 6 Forest plot for Meta-analysis of association between MTHFR C677T and G3-4 oral mucositis（T vs.C）

亞組分析結果表明，高加索與亞洲人群、患兒與混合人群間差異均沒有顯著性（P亞組＞0.05）。

②敏感性分析、異質性分析與發表偏倚分析。對口腔黏膜炎發生率的4個Meta分析結果進行敏感性分析。由于Meta分析均只納入2項研究，剔除任華益等[10]或Park JA等[17]的研究后，Meta分析合并效應量均發生顯著改變，即整體穩定性與可靠性欠佳。上述Meta分析均無顯著異質性，P異質性均＞0.10。此外，由于納入研究數量的限制，發表偏倚仍無法排除。

2.3.4 血液毒性、消化道毒性、整體不良事件發生率 ①血液毒性發生率方面，任華益等[10]提示隱性遺傳模型下MTHFR C677T多態性與白細胞減少、G3-4白細胞減少的發生風險顯著相關（P＜0.05），Ana Patino-Garcia等[21]提示MTHFR C677T多態性與G3-4血液毒性的發生風險顯著相關（P＜0.05），而Lambrecht L等[11]提示MTHFR C677T多態性與粒細胞減少、血小板減少、血紅蛋白降低均無顯著相關性（P＞0.05）。②消化道毒性發生率方面，Jabeen S等[18]提示MTHFR C677T多態性與消化道毒性顯著相關（P＜0.05）。③整體不良事件發生率方面，周新科等[19]提示MTHFR C677T多態性與整體不良事件無顯著相關性（P＞0.05）。

2.4 MTHFR A1298C多態性與HD-MTX不良反應的相關性分析

5項研究[17-21]報道了MTHFR A1298C基因多態性與HD-MTX不良反應的相關性。僅單項研究報道了相關結局指標的具體數據，因此進行描述性分析。（1）血液毒性發生率方面，Windsor RE等[20]的研究中MTHFR A1298C多態性與血紅蛋白降低顯著相關（P＜0.05），而Ana Patino-Garcia等[21]研究中表明無此相關性。（2）肝毒性發生率方面，Park JA等[17]與Jabeen S等[18]提示，MTHFR A1298C多態性與肝毒性、G1-2肝毒性、G3-4肝毒性均無顯著相關性（P＞0.05）。（3）腎毒性發生率方面，Park JA 等[17]與 Ana Patino-Garcia 等[21]提 示 ，MTHFR A1298C多態性與腎毒性、G1-2腎毒性、G3-4腎毒性（AA/ACvs.CC：OR＝0.52）均無顯著相關性（P＞0.05）。（4）口腔黏膜炎發生率方面，Park JA等[17]與Jabeen S等[18]提示，MTHFR A1298C多態性與口腔黏膜炎、G1-2口腔黏膜炎、G3-4口腔黏膜炎（AA/ACvs.CC：OR＝0.40）均無顯著相關性（P＞0.05）。（5）消化道毒性發生率方面，Ana Patino-Garcia等[21]提示無顯著相關性（P＞0.05）。（6）整體不良事件發生率方面，周新科等[19]也提示無顯著相關性（P＞0.05）。

2.5 RFC1 G80A多態性與HD-MTX不良反應的相關性分析

4項研究[16-18，21]報道了RFC1G80A基因多態性與HD-MTX不良反應的相關性。僅單個研究報道了相關結局指標的具體數據，因此進行描述性分析。（1）血液毒性發生率方面，2項研究[16，21]提示無顯著相關性（P＞0.05）。（2）肝毒性發生率方面，3項研究[16-18]提示，RFC1G80A多態性與肝毒性、G1-2肝毒性、G3-4肝毒性（AA/GAvs.GG：OR＝0.27）無顯著相關性（P＞0.05）。（3）腎毒性發生率方面，2項研究[17，21]提示，RFC1G80A多態性與腎毒性、G1-2腎毒性、G3-4腎毒性（AA/GAvs.GG：OR＝0.81）無顯著相關性（P＞0.05）。（4）口腔黏膜炎發生率方面，Park JA等[17]提示亞洲患兒中RFC1G80A多態性與G1-2口腔黏膜炎（AA/GAvs.GG：OR＝16.80）、G3-4口腔黏膜炎（AA/GAvs.GG：OR＝0.06）顯著相關（P＜0.05），而在Jabeen S等[18]的研究中無顯著相關性。（5）消化道毒性發生率方面，Ana Patino-Garcia等[21]提示RFC1G80A多態性與消化道毒性無顯著相關性（P＞0.05）。

2.6 MDR1 C3435T多態性與HD-MTX不良反應的相關性分析

僅2項研究[16，20]報道了高加索人群中MDR1C3435T多態性與HD-MTX不良反應的相關性。Windsor RE等[20]指出，MDR1C3435T多態性與口腔黏膜炎發生風險有顯著相關性（CCvs.TT：OR＝7.5，P＜0.05）。而Hegyi M等[16]提示，MDR1C3435T多態性與血液毒性、肝毒性無顯著相關性（Tvs.C：P＞0.05）。

3 討論

3.1 基因多態性與HD-MTX不良反應的相關性

基于對 6 項研究[10-11，17-19，21]的 Meta分析和描述性分析，本研究發現，骨肉瘤患者中MTHFR C677T突變可能導致HD-MTX不良反應的發生風險增加，如G3-4血液毒性、腎毒性、G3-4腎毒性、口腔黏膜炎、G3-4口腔黏膜炎、消化道毒性等，但不包括惡性血液腫瘤患者中與MTHFR C677T顯著相關的肝毒性[22-23]。受Meta分析納入的研究數量限制，亞組分析未能充分開展，但基于年齡分層的亞組分析表明，MTHFR C677T與HD-MTX特定不良反應（G3-4腎毒性）的相關性還可能受年齡影響?；趯?項研究[17-21]的Meta分析和描述性分析，本文發現MTHFR A1298C多態性可能與更低的G3-4毒性風險有關，如G3-4肝毒性、G3-4腎毒性、G3-4口腔黏膜炎，但均無統計學意義?？傮w來說，骨肉瘤患者中MTH-FR C677T突變可能導致HD-MTX不良反應發生風險增加，而MTHFR A1298C多態性可能導致不良反應發生風險降低（但無統計學意義），這與血液惡性腫瘤患者中系統評價的研究相關結果[7，22-23]大體一致。

基于對4項研究[16-18，21]的描述性分析，本文發現骨肉瘤患者中RFC1G80A多態性與HD-MTX不良反應無顯著相關性，與血液惡性腫瘤患者中系統評價的研究結果類似[24]，但相關性還可能受種族、年齡、不良事件的定義與分級影響?；趯?項研究[16，20]的描述性分析，僅納入較小樣本量的單個研究提示MDR1C3435T突變可能降低口腔黏膜炎發生風險，但其他結局指標中均無相關性?？傮w來看，由于受納入研究數量與質量的限制，RFC1G80A或MDR1C3435T多態性與HD-MTX不良反應的相關性仍不明確。

3.2 HD-MTX相關不良反應的發生機制

同多數藥源性不良反應類似，HD-MTX引起不良反應的機制也尚不明確。MTX的血漿蛋白結合率約50%，部分經肝細胞代謝轉化為多聚谷氨酸化的MTX（PGMTX），PGMTX被認為是MTX發揮抗增殖活性的活性物[25]。MTX幾乎90%通過腎經尿液以原型排泄，少量藥物以原型排泄入膽汁并進入腸肝循環，大約10%原型藥物會由肝的醛氧化酶代謝為7-羥基MTX（7-OHMTX）[26]。大部分MTX會在給藥后12 h內排泄，少量MTX及其代謝產物以結合型（PGMTX、7-OHMTX）貯存于腎和肝等組織中。HD-MTX相關不良反應多見于代謝與增殖迅速的組織，如骨髓、肝、腎、消化道等，HD-MTX對不同系統、器官產生損傷的機制可能不一致。由于MTX對上皮細胞具有直接損傷作用，口腔黏膜炎常是HD-MTX毒性反應的最早期癥狀，且與較高水平的MTX血藥濃度有關[27]。而HD-MTX相關的肝、腎損傷則可能與蓄積在肝、腎組織的PGMTX、7-OHMTX有關，不一定因較高的MTX血藥濃度引起。與游離MTX相比，PGMTX對二氫葉酸還原酶（DHFR）的結合親和力更強，抑制作用更強，且更易于在細胞內蓄積，因此PGMTX的抗增殖活性更強，也導致不良反應發生風險更高、程度更嚴重[28]。與游離MTX相比，7-OHMTX對DHFR抑制作用較弱，但因水溶性較差，易于在腎內沉積、進而導致腎損害[29]。

3.3 本研究的優勢、意義與局限性

目前，尚無針對骨肉瘤患者中上述基因多態性和HD-MTX不良反應相關性的系統評價。HD-MTX用于骨肉瘤時劑量可達10 g/m2，劑量為惡性血液腫瘤患者中3倍以上，更高的MTX血藥濃度和更長的暴露時間導致骨肉瘤患者中MTX代謝產物（如PGMTX、7-OHMTX）水平顯著高于惡性血液腫瘤患者，因此二者不良反應發生率與嚴重程度也有所不同。本研究首次系統回顧并整合了骨肉瘤患者的有關研究證據，但尚存在以下局限性：目前相關的原始研究數與樣本量均較少，未能充分開展亞組分析，Meta分析結果的穩定性一般，且發表偏倚無法排除，仍需要進一步擴大樣本驗證本研究結論。此外，不同研究間結局指標的分級與定義存在差異，且部分研究未報告結局指標具體數值，所以部分結局指標無法納入Meta分析，只可進行描述性分析。因此，仍需要多中心、更大樣本量、更高質量的原始研究評估骨肉瘤中相關基因多態性對HD-MTX不良反應的影響。

綜上所述，骨肉瘤患者中MTHFR C677T突變可能導致HD-MTX不良反應（如G3-4血液毒性、腎毒性、口腔黏膜炎、消化道毒性）發生風險增加，MTHFR A1298C多態性與HD-MTX不良反應無顯著相關性。RFC1G80A或MDR1C3435T多態性與HD-MTX不良反應的相關性尚不明確。臨床用藥時，應結合MTHFR基因的檢測結果與患者個體的臨床情況，綜合評估HD-MTX不良反應發生風險，必要時進行劑量調整，以最大限度地保證HD-MTX臨床用藥的安全性，最終改善骨肉瘤患者的臨床結局。