芪藶強心膠囊中芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚在大鼠體內的藥動學研究Δ

張瑜，張富賡，張少強，朱明丹，肖學鳳，杜武勛#

（1.天津中醫藥大學研究生院，天津301617；2.天津市環湖醫院藥劑科，天津 300350；3.天津中醫藥大學第二附屬醫院心血管內科，天津 300150；4.天津中醫藥大學中藥學院，天津 301617）

芪藶強心膠囊由《金匱要略》中的葶藶大棗瀉肺湯加減而成[1]，由黃芪、附子、人參、丹參、葶藶子等11味飲片組成，用以治療輕、中度充血性心力衰竭，具有益氣溫陽、活血通絡、利水消腫的功效[2]。對于高血壓、心肌病、冠心病、肺心病等合并慢性心力衰竭患者，在標準西醫治療基礎上，加用芪藶強心膠囊能夠進一步緩解臨床癥狀，減輕藥物副作用[3-5]。相關研究表明，芪藶強心膠囊不僅具有強心、利尿、擴血管作用，同時還能通過抑制心肌炎癥反應與抗氧化應激，改善心肌細胞能量代謝，抑制心室重構[6-7]。芪藶強心膠囊中是哪些有效成分進入體內發揮藥效作用暫不明確。中藥藥動學是目前闡明這些問題的根本途徑[8-9]。因此，本課題組根據中藥君臣佐使的配伍原則，以芪藶強心膠囊中臣藥葶藶子為研究對象進行藥動學研究，其中葶藶子的有效成分主要以芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚為主[10-13]。基于此，筆者建立高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）法，考察芪藶強心膠囊臣藥葶藶子中芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚在大鼠體內的藥動學，為進一步明確芪藶強心膠囊的藥效物質基礎提供依據。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A色譜儀（日本島津公司）；API 4000質譜儀（美國應用生物系統公司）；XS 205電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；MIKRO 220R低溫高速離心機（德國Hettich公司）；Sorvall RC-6Plus離心機（美國Thermo公司）；Targin VX-02多管蝸旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

芪藶強心膠囊（石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號：140805，其中芥子堿硫氰酸鹽1.167 mg/g、槲皮素0.019 mg/g、山柰酚0.030 mg/g）；芥子堿硫氰酸鹽對照品（批號：111702-201504，純度：99.5%）、槲皮素對照品（批號：100081-201509，純度：98.6%）、山柰酚對照品（批號：110861-201509，純度：99.0%）、氯霉素（內標）對照品（批號：130555-201203，純度：99.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲酸為分析純，水為超純水。

1.3 動物

SD大鼠，♂，6只，體質量（220±20）g，SPF級，由解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK（軍）-2014-0004，動物房溫度（22±2）℃，濕度（50±10）%，適應性喂養1周后進行實驗。本實驗經過天津中醫藥大學倫理委員會批準。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZOBRAX XDB-C18（50 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液（B）梯度洗脫（0.01～0.6 min，7%B；0.6～0.8 min，7% →15%B；0.8～7.8 min，15%→65%B；7.8～8.8 min，65%→100%B；8.8～9.8 min，100%B；9.8～9.81 min，100%→7%B；9.81～12 min，7%B）；流速：0.45 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10μL。

2.1.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；檢測模式：負離子模式；掃描方式：多反應監測（MRM）；噴霧電壓：－4 200 V；脫溶液溫度：600 ℃；氣簾氣：20 L/min；霧化氣：65 L/min；加熱輔助氣：55 L/min。定量離子為芥子堿硫氰酸鹽質荷比（m/z）310.2→251.2（解簇電壓：－170 V，碰撞能量：－52 V，出口電壓：－13 V），槲皮素m/z301.1→150.7（解簇電壓：－70 V，碰撞能量：－26 V，出口電壓：－5 V），山柰酚m/z286.2→242.0（解簇電壓：－75 V，碰撞能量：－46 V，出口電壓：－11 V），氯霉素m/z320.9→151.9（解簇電壓：－50 V，碰撞能量：－20 V，出口電壓：－15 V）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚對照品適量，以二甲基亞砜（DMSO）溶解制成質量濃度為2 mg/mL的對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液適量，通過甲醇-水溶液（1∶1，V/V）稀釋得到芥子堿硫氰酸鹽質量濃度為0.5、1、2.5、10、25、100、250、1 000 ng/mL、槲皮素及山柰酚質量濃度均為1、2、5、20、50、200、500、2 000 ng/mL的混合對照品溶液。以上溶液均保存于4℃冰箱。

2.2.2 內標溶液的制備 精密稱取氯霉素對照品適量，用甲醇-乙腈溶液（1∶1，V/V）溶解并制成質量濃度為20 ng/mL的內標溶液，置于4℃貯存備用。

2.3 血漿樣品處理

取大鼠血漿樣品50 μL，加入10 μL維生素C溶液（1.4 mg/mL，抗氧化劑）和150 μL 內標溶液，蝸旋30 s，離心10 min（4 ℃，15 000 r/min），取上清液，氮氣吹干，測定前用100 μL 50%甲醇水復溶，取10μL進樣分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性 取空白血漿、空白血漿+混合對照品溶液、灌胃給藥20 min后大鼠血漿，按“2.3”項下方法處理血漿樣品，再按“2.1”項下色譜及質譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果，芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素、山柰酚和氯霉素互不干擾，峰形良好，且不會受到大鼠血漿樣品中雜質及內源性物質的干擾，表明方法專屬性良好。典型MRM色譜圖見圖1。

圖1 典型MRM色譜圖Fig 1 Representation MRM chromatograms

2.4.2 線性關系與定量下限 取空白血漿50 μL，分別加入不同質量濃度的芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚的混合對照品溶液，配制成芥子堿硫氰酸鹽質量濃度為0.05、0.1、0.25、1、2.5、10、25、100 ng/mL，槲皮素和山柰酚質量濃度均為0.1、0.2、0.5、2、5、20、50、200 ng/mL的系列溶液。按“2.3”項下方法處理血漿樣品，“2.1”項下色譜及質譜條件進樣分析，以各成分對照品質量濃度為橫坐標（x），對照品與內標峰面積比值為縱坐標（y）進行線性回歸，得到芥子堿硫氰酸鹽的回歸方程為y＝2.91×10－2x+0.015（r＝0.999 4），線性范圍為0.05～100 ng/mL，定量下限為0.05 ng/mL；槲皮素的回歸方程為y＝4.5×10－3x+0.001 7（r＝0.999 7），線性范圍為0.1～200 ng/mL，定量下限為0.1 ng/mL；山柰酚的回歸方程為y＝8.0×10－4x+0.001 3（r＝0.999 9），線性范圍為0.1～200 ng/mL，定量下限為0.1 ng/mL。

2.4.3 精密度與準確度 取空白血漿，分別加入適量混合對照品溶液，得到芥子堿硫氰酸鹽（0.1、1、80 ng/mL）、槲皮素（0.2、2、160 ng/mL）、山柰酚（0.2、2、160 ng/mL）低、中、高3個質量濃度的血漿質控樣品（QC），按“2.3”項下方法處理血漿樣品，按“2.1”項下色譜及質譜條件進樣分析，記錄峰面積。于同日內連續進樣6次，計算日內精密度及準確度；連續測定3 d，計算日間精密度及準確度。結果，血漿中芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素、山柰酚日內精密度的RSD均≤9.63%（n＝6），準確度在94.67%～101.21%、98.11%～102.00%、100.17%～102.71%之間；日間精密度的RSD均≤11.55%（n＝6），且準確度分別在98.43%～99.20%、98.97%～102.88%、99.54%～102.85%之間，滿足生物樣品測定的要求。

2.4.4 基質效應 取空白血漿50 μL，加入芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素及山柰酚低、中、高3個質量濃度的QC樣品，每個質量濃度平行制備6份，按“2.3”項下方法處理血漿樣品，再按“2.1”項下色譜及質譜條件進樣分析，記錄各成分峰面積（A）；另取甲醇水溶液代替空白血漿，測得成分峰面積（B），基質效應計算公式為A/B×100%。結果，芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素、山柰酚血漿樣品低、中、高3個質量濃度的基質效應分別為101.61%～86.70%（RSD≤7.63%，n＝6）、101.41%～80.94%（RSD≤9.61%，n＝6）、79.92%～103.24%（RSD≤6.03%，n＝6）。基質效應結果見表1。

表1 基質效應結果Tab 1 Results of matrix effect

2.4.5 穩定性試驗 取空白血漿50 μL，加入芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素及山柰酚低、中、高3個質量濃度的QC樣品，按“2.3”項下方法處理血漿樣品后，分別在室溫放置24 h、自動進樣器中放置24 h、－20℃條件下反復凍融3次、－80℃條件下放置30 d考察樣品穩定性。結果，芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素、山柰酚樣品在上述條件下穩定，各成分測得濃度均值與標示濃度的RE≤14.69%。

2.5 藥動學研究

取大鼠6只，給藥前禁食12 h，自由飲水。灌胃給予1.3 g/kg芪藶強心膠囊混懸液[根據臨床用量換算而得，人與大鼠的換算系數Rab為6.17[14]]，于給藥后0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h經目內眥靜脈叢取血約0.5 mL，置于肝素化抗凝管中，離心10 min（4 ℃，12 000 r/min），取上層血漿，按“2.3”項下方法處理血漿樣品，并按“2.1”項下色譜及質譜條件進樣分析，采用DAS 3.0軟件非房室模型計算藥動學參數。結果，大鼠灌胃芪藶強心膠囊后血漿中芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚的藥-時曲線見圖2，主要藥動學參數見表2。

圖2 大鼠體內芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚的藥-時曲線Fig 2 Plasma concentration-time curves for sinapine thiocyanate，quercetin and kaempferol in rats

表2 大鼠灌胃芪藶強心膠囊后芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚的藥動學參數（±s，n＝6）Tab 2 Pharmacokinetic parameters for sinapine thiocyanate，quercetin and kaempferol in rats after intragastric administration of Qili qiangxin capsule（±s，n＝6）

表2 大鼠灌胃芪藶強心膠囊后芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚的藥動學參數（±s，n＝6）Tab 2 Pharmacokinetic parameters for sinapine thiocyanate，quercetin and kaempferol in rats after intragastric administration of Qili qiangxin capsule（±s，n＝6）

藥動學參數cmax，ng/mL tmax，h t1/2，h CL，mL/（h·kg）Vd，mL·h/kg AUC0-24 h，h·ng/mL AUC0-∞，h·ng/mL芥子堿硫氰酸鹽1．35±0．62 1．5±0．00 3．98±0．99 3 683．82±987．96 28 715．50±7 659．82 3．98±1．21 8．76±2．85槲皮素3．23±1．26 0．67±0．00 3．33±0．41 2 852．33±695．88 13 998．15±4 878．43 10．96±3．42 15．03±5．28山柰酚5．26±1．66 0．67±0．00 4．54±0．85 1 611．85±129．59 10 356．47±1 402．80 13．59±5．35 18．91±1．54

3 討論

芪藶強心膠囊長期應用于臨床，可顯著降低慢性心力衰竭患者明尼蘇達生活質量評分、減少復合終點事件發生率[15-16]。其相關的藥理作用報道較多，但芪藶強心膠囊方中潛在效應成分的藥動學特征研究較少，而復方藥動學研究對于揭示中藥作用的物質基礎及作用機制，促進中醫藥的現代化具有重要的意義[17-19]。因此，本課題組以臣藥葶藶子為例，分別選擇質量控制成分芥子堿硫氰酸鹽和藥物效應成分槲皮素、山柰酚對芪藶強心膠囊在大鼠體內的藥動學特征進行考察。

藥動學結果顯示，大鼠灌胃芪藶強心膠囊后槲皮素、山柰酚可被快速吸收入血，0.67 h即達到峰濃度（cmax），cmax分別為（3.23±1.26）、（5.26±1.66）ng/mL，芥子堿硫氰酸鹽達峰時間在1.5 h左右，cmax為（1.35±0.62）ng/mL；3種成分在生物體內清除較快，半衰期（t1/2）相接近，在3.33～4.54 h之間，且芥子堿硫氰酸鹽的血漿清除率[CL＝3 683.82 mL/（h·kg）]高于槲皮素[CL＝2 682.33 mL/（h·kg）]及山柰酚[CL＝1 611.85 mL/（h·kg）]，說明前者被代謝的速度最快，在體內停留的時間最短；表觀分布容積（Vd）通常與血藥濃度成反比，代表藥物的組織攝取程度[20]，本實驗中Vd從大到小排序依次為芥子堿硫氰酸鹽＞槲皮素＞山柰酚，說明芥子堿硫氰酸鹽的組織攝取度多，體內分布廣泛；AUC反映藥物進入人體循環的相對量，是衡量藥物利用程度的重要參數[21]，本實驗中芥子堿硫氰酸鹽的AUC明顯低于槲皮素、山柰酚，這可能與芥子堿硫氰酸鹽在體內清除率高、分布容積大而降低了體內的暴露量有關。

本研究建立了HPLC-MS/MS法測定芪藶強心膠囊臣藥葶藶子中主要成分芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素、山柰酚在大鼠體內的血藥濃度，并闡釋各效應成分的體內過程，可為進一步確定芪藶強心膠囊的藥效物質基礎提供依據。