HPLC法測定利福布汀原料藥及膠囊中有關物質Δ

易秋艷，崔學文，羅軍，劉文躍，袁軍#

（1.四川省食品藥品檢驗檢測院微生物中心，成都611731；2.四川明欣藥業有限責任公司質量部，成都 611130）

結核病是由結核桿菌感染引起的慢性傳染病，肺結核對個人、家庭和社會的危害極大[1]。利福布汀為利福霉素S的螺旋哌啶衍生物，在臨床中主要用于分支桿菌感染所致疾病如結核及鳥分枝桿菌-胞內分支桿菌復合體（MAC）感染，其對結核桿菌的抑制作用比利福平約強4倍[2]，應用前景良好。目前，利福布汀（原料藥）及利福布汀膠囊僅一家企業生產，批準文號為國藥準字H20070294（利福布汀）、H20070296（利福布汀膠囊）；現行質量標準為國家食品藥品監督管理局批準的YBH05792007[3]（利福布?。?、YBH05812007[4]（利福布汀膠囊），在這兩個標準中，有關物質的檢查均采用高效液相色譜（HPLC）法測定，色譜系統相同，但筆者經試驗后發現此現行方法中利福布汀與相鄰雜質峰不能達到有效分離，雜質檢出率較低，經網上檢索后也未見利福布汀有關物質檢查研究的相關文獻報道。為此，筆者參照《美國藥典》（USP）[5]、《歐洲藥典》（EP）9.0[6]和相關文獻[7-15]，對現行方法進行了改進，以提高雜質檢出率，提高對該產品的質量控制水平。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010CHT高效液相色譜（HPLC）儀（日本Shimadzu公司）；2695 HPLC儀（美國Waters公司）；CPA225D十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

利福布汀原料藥（批號：15070356、16050656、17020156，純度：96.6%、97.3%、97.0%）、利福布汀膠囊（批號：16010157、16010257、17090257，規格：0.15 g）均來源于四川明欣藥業有限責任公司；利福布汀對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130586-200901，純度：97.2%）；水為超純水，乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C8（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用2 mol/L氫氧化鈉調pH至6.5±0.1）（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.1.2 系統適用性試驗 取約10 mg利福布汀原料藥，用2 mL甲醇溶解后，加2 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，靜置4 min，加2 mol/L鹽酸溶液1 mL中和，再用流動相稀釋至50 mL。取此溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，利福布汀峰前應出現1個大的及2個小的降解產物峰。利福布汀峰與相鄰降解產物峰之間的分離度應不小于1.3；理論板數按利福布汀峰計應不低于2 000。系統適用性試驗色譜圖見圖1A。

圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability tests

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 （1）原料藥。取適量本品，精密稱量，以流動相溶解并稀釋制成每1 mL中含利福布汀1.0 mg的溶液，即得。（2）膠囊。取內容物適量，精密稱量，以流動相溶解并稀釋制成每1 mL中含利福布汀1.0 mg的溶液，濾過，取續濾液即得。

2.2.2 對照溶液 取適量利福布汀對照品，以流動相溶解并稀釋制成每1 mL中含利福布汀0.01 mg的溶液，作為對照溶液。

2.2.3 靈敏度溶液 取對照溶液適量，以流動相準確稀釋20倍，即得。

2.3 線性關系考察

取用流動相逐級稀釋的利福布汀對照品系列溶液（每 1 mL 中含利福布汀 0.000 8、0.001、0.010、0.012、0.016 mg），測定峰面積，以質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y），進行線性回歸，得線性方程為y＝4.114×107x+7.178×102（r＝1.000 0），利福布汀的檢測質量濃度線性范圍為0.000 8～0.016 mg/mL。

2.4 專屬性試驗

取利福布汀原料藥（批號：17020156）和膠囊（批號：16010157）內容物適量，分別加入2 mol/L鹽酸溶液1 mL，破壞15 min，得酸破壞后樣品；用0.25 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，破壞2 min，得堿破壞后樣品；用6%過氧化氫溶液2 mL，破壞8 min，得氧化破壞后樣品；用130℃高溫破壞6 h，得高溫破壞后樣品；用大于4 000 lx的光近距離照射7 d，得光照破壞后樣品；取上述各破壞后樣品及未破壞的樣品按“2.2.1”項下方法制備成供試品溶液并進樣檢測。結果，檢出多個降解峰，且均不干擾主峰的檢測。專屬性試驗色譜圖見圖2。

2.5 檢測限與定量限考察

確定測定峰高約為基線噪音3倍時為檢測限、10倍時為定量限，結果利福布汀的檢測限為0.025 4 μg/mL，定量限為0.085 2 μg/mL，定量限相當于供試品進樣量的0.009%，靈敏度符合要求。

2.6 精密度試驗

取“2.3”項下利福布汀對照品溶液（0.010 mg/mL），連續測定6次，計算得利福布汀峰面積的RSD為0.07%（n＝6），表明儀器精密度較好。

2.7 重復性試驗

分別取同一批利福布汀原料藥及膠囊樣品，按“2.2.1”項下方法制備成供試品溶液，平行6份，測定供試品溶液中利福布汀及其雜質總含量。結果，原料藥（批號：17020156）中雜質總含量的RSD為1.8%（n＝6），膠囊（批號：16010157）中雜質總含量的RSD為1.4%（n＝6）；原料藥（批號：17020156）中利福布汀含量的RSD為0.77%（n＝6），膠囊（批號：16010157）中利福布汀含量的RSD為0.92%（n＝6），表明方法重復性好。

2.8 穩定性試驗

精密稱取利福布汀原料藥（批號：17020156）和利福布汀膠囊（批號：16010157）內容物適量，分別按“2.2.1”項下方法制成供試品溶液，放置于室溫，分別在0、2、4、8、10、12 h進樣測定，計算各雜質的峰面積。結果，原料藥中利福布汀峰面積的RSD為0.07%（n＝6），膠囊中利福布汀峰面積的RSD為0.10%（n＝6），表明原料藥和膠囊的供試品溶液在12 h內穩定。

圖2 專屬性試驗的高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of specification test

2.9 耐用性試驗

微調流動相流速（0.9、1.1 mL/min）、流動相中乙腈比例（45%、55%）、流動相 pH（6.3、6.7）、柱溫（25、35 ℃）、不同色譜柱（Kromasil C8、Sepax C8，規格：均為250 mm×4.6 mm，5 μm），用系統適用性溶液按上述條件進行耐用性試驗。結果，各峰的分離度良好，表明方法耐用性較好。耐用性試驗結果見表1。

表1 耐用性試驗結果Tab 1 Results of durability tests

2.10 有關物質檢查法

精密量取“2.2”項下3種溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積（1.0%），大于對照溶液主峰面積0.5倍（0.5%）的峰不得多于1個。各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的3倍（3.0%）。供試品溶液色譜圖中小于靈敏度溶液主峰面積的峰可忽略不計（0.05%）。

2.11 與現行方法比較

2.11.1 色譜條件 在現行方法的供試品溶液制備中，采用先加乙腈溶解再用流動相稀釋的方法，制備的質量濃度約為0.5 mg/mL；而新方法的供試品溶液制備時，直接用流動相溶解并稀釋制成質量濃度約為1.0 mg/mL的溶液。此新方法中的供試品溶液制備方法，可適當消除溶劑效應，且在進樣體積相同的情況下將樣品量提高了1倍，這將更有利于雜質的檢出。另外，在現行方法中，采用C18柱進行分離，而改進方法參照USP、EP的方法，選用C8柱進行試驗。

2.11.2 系統適用性試驗 取利福布汀原料藥（批號：17020156）按“2.1.2”項下方法制備系統適用性試驗溶液，采用現行方法和新方法，進樣分析，結果見圖1A、B。

由圖1可見，在現行方法中，利福布汀峰與相鄰的降解峰3之間的分離度為3.47，遠小于新方法中利福布汀峰與降解峰3的分離度7.50；另外，采用現行方法時，利福布汀主峰的保留時間約為30 min，較新方法的24 min更長；故新方法的色譜分離能力優于現行方法，且檢測時間更短。

2.11.3 樣品中有關物質的檢查 按“2.10”項下方法測定原料藥和膠囊的有關物質（峰面積歸一化法），采用現行方法和改進方法進行檢查的結果見表2、表3，色譜圖見圖3、圖4。

表2 采用現行方法檢查利福布汀及膠囊中有關物質的結果Tab 2 Determination of related substances in rifabutin crude drug and capsules by current methods

表3 采用新方法檢查利福布汀及膠囊中有關物質的結果Tab 3 Results of related substances in rifabutin crude drug and capsules by new methods

圖3 原料藥中有關物質檢查高效液相色譜圖（批號：15070356）Fig 3 HPLC chromatograms of related substance in crude drug（No.15070356）

由表2、表3及圖3、圖4可見，采用新方法檢出的雜質個數較現行方法多1～5個，雜質總量高出0.19%～0.55%，新方法與現行方法比較主峰峰形更好，與雜質峰分離更好，檢出的雜質個數更多。

圖4 膠囊中有關物質檢查高效液相色譜圖（批號：17090257）Fig 4 HPLC chromatograms of related substance in capsules（No.17090257）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 色譜柱的選擇 現行方法采用C18柱進行分離，而新方法參照USP和EP的方法，選用C8柱進行試驗，且色譜柱規格選用了國內常見的250 mm×4.6 mm。由系統適用性試驗結果可見，在利福布汀主峰與其前相鄰雜質峰的分離方面，新方法的C8柱優于現行方法的C18柱。

3.1.2 溶劑的選擇 在現行方法中，基于利福布汀在乙腈中易溶的特點，所以選用乙腈為溶劑溶解樣品后再用流動相稀釋至刻度的方法。在新方法中，雖然制備的供試品溶液質量濃度更高，但只用流動相依然能夠很好地溶解樣品。故最終只選用流動相作為溶劑，消除了先加入乙腈后帶來的溶劑效應。

3.2 對樣品破壞試驗的探討

從強制破壞試驗結果可以看出，利福布汀原料藥在試驗設計的光照、氧化、酸、熱和堿降解條件下均發生降解。在按峰面積歸一化法計算雜質含量時，筆者發現利福布汀在氧化降解條件下相對保留時間約為0.41的雜質比未破壞時約增加了0.5%；在酸降解條件下相對保留時間約為0.64的雜質比未破壞時約增加了1.2%；在高溫降解條件下相對保留時間約為0.19、0.25和0.41的雜質比未破壞時分別增加了0.5%、1.1%和0.5%；在堿降解條件下相對保留時間約為0.45、0.64和0.75的雜質比未破壞時分別增加了2.4%、4.7%和1.5%。故認為對試驗中主要降解產物的結構分析有待進一步研究，以便更好地控制利福布汀的質量。

綜上，采用新方法進行利福布汀原料藥和膠囊中有關物質的檢查，方法適用性良好，且與現行方法相比較，有出峰更快、峰形更好、分離雜質更多的優點。故新的方法靈敏、簡單，適用于對利福布汀原料藥及膠囊的有關物質檢查。