HPLC-DAD法同時測定血脂康膠囊中8個成分的含量Δ

李媛，孫鑫

（江蘇食品藥品職業技術學院藥學院，江蘇淮安223003）

紅曲（Red yeast rice，RYR）為曲霉科真菌紅曲霉Monascus purpureusWent.的菌絲體寄生在粳米上而成的紅曲米，具有健脾消食、活血化瘀之功效[1]。血脂康膠囊是以紅曲為主要原料，經過特殊工藝提煉制作而成的抗高血脂藥物[2]。血脂康膠囊能顯著降低患者血清中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）的水平，同時還能夠減少伴有血脂異常的冠心病患者的心血管事件的發生，安全性較高[3]。現代醫學研究結果表明，血脂康膠囊中的活性成分主要分為兩類：一類為以洛伐他汀、洛伐他汀羥基酸和美伐他汀等為代表的他汀類化合物，另一類為以大豆苷、染料木苷、黃豆黃素等為代表的異黃酮類成分[2-4]。血脂康膠囊的現行質量標準收載于2015年版《中國藥典》（一部）中[5]，其含量測定項僅以洛伐他汀為質控成分。然而，現有研究顯示，血脂康膠囊中的其余他汀類成分（洛伐他汀羥基酸和美伐他汀）以及異黃酮類成分（大豆苷和染料木苷）在抗高血脂中也有重要的作用[4，6]。因此，僅控制血脂康膠囊中洛伐他汀的含量，很難全面反映其質量，因而限制了其臨床應用。目前對血脂康膠囊制劑的質量控制研究也僅僅局限于洛伐他汀等他汀類成分的定量分析[7-8]。為了較為全面地控制血脂康膠囊的質量，有必要同時對血脂康膠囊中的他汀類和異黃酮類成分進行定量分析。本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）-二極管陣列檢測器（DAD）法同時測定血脂康膠囊中8個活性成分，包括5個異黃酮類成分（大豆苷元、大豆苷、黃豆黃素、染料木素和染料木苷）和3個他汀類化合物（洛伐他汀、洛伐他汀羥基酸和美伐他汀）的含量。并將此方法用于分析不同批次的血脂康膠囊，旨在為完善血脂康膠囊的質量控制標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010A（HT）型HPLC儀，包括四元梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、DAD、LC Solution色譜工作站（日本Shimadzu公司）；KH-500DB數控超聲波清洗器（上海滬粵明科學儀器有限公司）；3K15高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；BT25S十萬分之一分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

8批血脂康膠囊（北大維信生物科技有限公司，批號：170324、170420、170608、170903、171209、171222、180422、180603）；大豆苷元（批號：MUST-15041107，純度：98%）、大豆苷（批號：MUST-15062218，純度：98%）、黃豆黃素（批號：MUST-17041419，純度：98%）、染料木素（批號：MUST-17040532，純度：98%）、染料木苷（批號：MUST-17030620，純度：98%）、洛伐他汀（批號：MUST-16072803，純度：98%）、洛伐他汀羥基酸（批號：MUST-17041001，純度：98%）7個對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司；美伐他汀對照品（大連美侖生物科技有限公司，批號：170809，純度：96%）；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，超純水由本實驗室EPED超純水系統制備。

8個對照品化合物的結構式見圖1。

圖1 血脂康膠囊中8個化合物的結構式Fig 1 Chemical structures of 8 compounds in Xuezhikang capsules

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，5%B→10%B；3～8 min，10%B→20%B；8～20 min，20%B→34%B；20～28 min，34%B→43%B；28～40 min，43%B→65%B；40～52 min，65%B→90%B；52～55 min，90%B→100%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：237 nm（洛伐他汀、洛伐他汀羥基酸和美伐他汀），256 nm（大豆苷元、大豆苷、黃豆黃素、染料木素和染料木苷）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀等對照品適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成每1 mL含大豆苷0.250 2 mg、染料木苷0.150 9 mg、大豆苷元0.113 3 mg、黃豆黃素0.150 6 mg、染料木素0.180 4 mg、洛伐他汀羥基酸0.201 2 mg、美伐他汀0.166 3 mg、洛伐他汀0.250 8 mg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取血脂康膠囊10粒，除去膠囊殼，傾倒出內容物，混勻并粉碎，過60目篩；精密稱取膠囊粉末約0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 mL，稱定質量，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱質量，用甲醇補足減失質量，于13 000 r/min離心10 min后，取上清液10 μL進樣分析。

2.3 系統適用性考察

分別精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液（批號：180603）各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果表明，在該色譜條件下，供試品溶液中的大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀色譜峰與其余組分色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數以洛伐他汀峰計不低于6 000。高效液相色譜圖見圖2。

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下的混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL，分別置于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得線性混合對照品工作液。精密吸取上述對照品工作液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分的峰面積，以各成分的質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸。8個成分的線性關系結果見表1。

2.5 檢測限與定量限考察

精密量取“2.2.1”項下的混合對照品溶液適量，用甲醇倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分的峰面積，分別以信噪比（S/N）為3和10時的各被測成分質量濃度確定其檢測限和定量限。結果，大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀的檢測限分別為0.25、0.13、0.45、0.12、0.21、0.24、0.12、0.15 μg/mL，定量限分別為0.84、0.36、1.29、0.41、0.65、0.78、0.33、0.50 μg/mL。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

表1 8個成分的線性關系結果Tab 1 Linear relationship of 8 components

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄各成分的峰面積，計算各峰面積的RSD值。結果，大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀峰面積的RSD分別為0.89%、2.37%、1.08%、1.54%、1.48%、0.49%、2.06%、1.19%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下同一份供試品溶液（批號：180603）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24、48 h后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分的峰面積，計算各峰面積的RSD值。結果，大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀峰面積的RSD分別為2.01%、1.03%、2.12%、2.89%、0.91%、2.18%、1.65%、1.19%（n＝6），表明血脂康膠囊供試品溶液在室溫下放置48 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取血脂康膠囊樣品（批號：180603）適量，按“2.2.2”項下的供試品溶液制備方法制備樣品，平行6份。將制備好的供試品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄目標成分的峰面積并計算其在樣品中的含量。結果，樣品中大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀含量的平均值分別為0.029、0.34、0.26、0.032、0.063、12.98、2.69、0.063 mg/g，RSD分別為 1.64%、0.56%、1.12%、2.26%、2.08%、1.33%、2.95%、1.19%（n＝6），表明本方法重復性好。

2.9 加樣回收率試驗

取血脂康膠囊內容物（批號：180603）適量，共6份，每份約0.15 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，分別加入大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并將供試品溶液于“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各成分的峰面積并計算回收率。回收率試驗結果見表2。

2.10 樣品含量測定

分別取8批血脂康膠囊樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄各成分的峰面積，采用外標法計算樣品中各成分含量。結果，8個批次血脂康膠囊樣品中洛伐他汀含量最高，但他汀類成分含量差異較大，尤其是洛伐他汀和洛伐他汀羥基酸；在異黃酮類成分中大豆苷元含量較高。樣品含量測定結果見表3。

3 討論

3.1 供試品制備方法的選擇

筆者在前期試驗中考察了不同提取條件對血脂康膠囊樣品提取效率的影響。（1）不同的提取溶劑：分別比較了不同提取溶劑（50%甲醇、75%甲醇、甲醇）對異黃酮類和他汀類成分含量測定的影響。發現以甲醇提取時，異黃酮類和他汀類目標分析物的含量較高，因此最終選用甲醇為提取溶劑；（2）不同提取時間：比較了不同提取時間（30、45、60 min）對異黃酮類和他汀類成分的含量測定的影響，結果發現不同成分的提取率在各提取時間內并無明顯差異。考慮效率因素，選擇了30 min為超聲提取時間。綜上，最終選擇甲醇超聲30 min作為血脂康膠囊供試品溶液制備方法中的主要條件。

3.2 檢測波長的選擇

筆者在前期試驗中采用DAD在190～400 nm波長范圍內對血脂康膠囊樣品中8個成分進行檢測，結果表明，他汀類成分在230、237和246 nm波長處有較大的紫外吸收，異黃酮類成分在256和330 nm波長處有最大紫外吸收。故參考文獻[9-10]選擇他汀類成分的檢測波長為237 nm，異黃酮類成分的檢測波長為256 nm。

3.3 流動相的選擇

在前期試驗中，筆者首先考察了乙腈-純水、甲醇-純水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相時的分離效果。結果表明，采用乙腈-純水比甲醇-純水的分析時間短，且加入甲酸后不僅能改善峰形，還有較好的分離度。因此，最終選定乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，在該分析條件下，各分析物的分離度均大于1.5，且峰形均較好。

表2 回收率試驗結果（n＝6）Tab 2Results of recovery test（n＝6）

表3 樣品含量測定結果（mg/g，n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（mg/g，n＝3）

3.4 含量測定結果分析

本次試驗結果表明，8個批次的血脂康膠囊樣品中洛伐他汀的含量均符合2015年版《中國藥典》（一部）標準（2.5 mg/粒）。但在8個批次的血脂康膠囊樣品中，他汀類成分含量差異較大，尤其是洛伐他汀和洛伐他汀羥基酸；大豆苷元在異黃酮類成分中含量較高。目標成分在血脂康膠囊樣品中的含量從高到低依次是洛伐他汀＞洛伐他汀羥基酸＞大豆苷元＞染料木素＞美伐他汀＞黃豆黃素＞染料木苷＞大豆苷。

中藥由于其多成分、多靶點的作用模式，只檢測單一有效成分以監控中藥制劑的質量有明顯的局限性[11]。隨著分析儀器的發展，同時監控中藥制劑中多個效應成分已成為控制中藥制劑質量的發展趨勢[12]。本試驗建立了HPLC-DAD法同時測定血脂康膠囊中的大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀的含量，該方法簡單、準確，且有良好的重復性，可為血脂康膠囊的質量控制研究提供參考。后續筆者將收集更多廠家的血脂康膠囊樣品，采用所建立的分析方法對這些指標成分進行分析檢測，以期為完善血脂康膠囊質量標準提供參考。