CETP基因-629C/A多態(tài)與辛伐他汀調(diào)血脂效果的相關(guān)性

李俊濤 陳志超 尹文

【摘要】 目的：探討辛伐他汀調(diào)血脂效果與膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CETP）基因啟動(dòng)子區(qū)-629C/A多態(tài)性的相關(guān)性。方法：采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)方法檢測(cè)265例經(jīng)辛伐他汀調(diào)脂治療的血脂異常患者CETP基因-629C/A多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率分布情況，并比較治療效果與該多態(tài)位點(diǎn)基因型之間的關(guān)系。結(jié)果：本研究對(duì)象中的-629C等位基因的頻率為55.1%，其中CC、CA、AA基因型患者分別為74例（27.9%）、144例（54.3%）、47例（17.7%）;治療后，各基因型LDL-C變化量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中AA和CA基因型LDL-C變化量下降幅度均多于CC型（P<0.05）。結(jié)論：辛伐他汀調(diào)血脂效果與CETP基因-629C/A多態(tài)性有關(guān)聯(lián)。

【關(guān)鍵詞】 辛伐他汀; 膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因; 血脂異常; 低密度脂蛋白膽固醇; 多態(tài)性

【Abstract】 Objective：To investigate the association between the lipid-regulating effect of Simvastatin with the -629C/A polymorphism in the CETP gene.Method：Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）was used to detect the genotype frequency distribution of the CETP gene-629C/A polymorphism locus in 265 patients with dyslipidemia treated with simvastatin，and the relationship between the therapeutic effect and the genotype of the polymorphism locus was analyzed.Result：The frequency of -629C allele was 55.1%，among them，74 cases（27.9%），144 cases（54.3%）and 47 cases（17.7%）were CC，CA and AA genotypes.After treatment，the changes of LDL-C in different genotypes was compared，the difference was statistically significant（P<0.01），and the changes of LDL-C in AA and CA genotypes decreased more than those of CC genotypes（P<0.05）.Conclusion：The CETP gene -629C/A polymorphism were associated with the lipid-regulating effect of Simvastatin.

【Key words】 Simvastatin; Cholesteryl ester transfer protein gene; Dyslipidemia; LDL-C; Polymorphism

First-authors address：Zhaoqing Medical College，Zhaoqing 526020，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.005

膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CETP）作為膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白因子，其主要功能是介導(dǎo)膽固醇酯（CE）和甘油三酯（TG）在高密度脂蛋白（HDL）和極低密度脂蛋白（VLDL）之間的交換。因此由CETP基因突變引起的血漿CETP活性的降低或喪失，可導(dǎo)致血漿HDL與低密度脂蛋白（LDL）水平的改變[1]。作為膽固醇合成限速酶β-羥β-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶的抑制劑，辛伐他汀是臨床上血脂異常患者常用的調(diào)血脂藥物之一，但流行病學(xué)相關(guān)試驗(yàn)已經(jīng)表明辛伐他汀的調(diào)血脂效果有個(gè)體差異性[2-3]。作為影響血漿脂蛋白代謝的關(guān)鍵蛋白因子，CETP基因成為影響他汀類(lèi)藥物調(diào)脂療效的敏感性基因之一[4]。近年來(lái)有關(guān)CETP基因多態(tài)與他汀類(lèi)藥物調(diào)脂療效的報(bào)道，多集中在CETP基因的內(nèi)含子和外顯子區(qū)域的多態(tài)位點(diǎn)[5-8]。-629C/A多態(tài)是位于CETP基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)功能性多態(tài)位點(diǎn)，且該位點(diǎn)與血漿脂蛋白水平相關(guān)聯(lián)[9]。故本研究對(duì)-629C/A多態(tài)在血脂異常患者中的基因型分布情況進(jìn)行了篩查，并進(jìn)一步探討了-629C/A多態(tài)與辛伐他汀調(diào)脂療效的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月-2018年1月肇慶醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院265例血脂異常患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者住院前6周內(nèi)無(wú)調(diào)脂藥物服用史;全部符合藥物治療標(biāo)準(zhǔn)，即TC≥6.22 mmol/L或LDL-C≥4.14 mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病、冠心病、肝腎功能不全、近期感染及手術(shù)史、腫瘤史者。患者住院后第2天開(kāi)始辛伐他汀治療，治療時(shí)間為4周（20 mg/d），對(duì)合并高血壓患者，用對(duì)血糖、血脂等代謝影響較小的鈣拮抗劑類(lèi)藥物來(lái)降低血壓。患者均對(duì)本研究知情同意，且已經(jīng)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法 （1）收集血液標(biāo)本及提取DNA：分別抽取患者治療前后外周靜脈血各5 mL（禁食12 h），并采用基因組DNA小量抽提試劑盒（購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司）提取DNA。（2）血脂水平檢測(cè)：由肇慶醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科對(duì)患者血液標(biāo)本進(jìn)行血脂水平的檢測(cè)，主要檢測(cè)的血脂指標(biāo)包括：總膽固醇（TC）、TG、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、極低密度脂蛋白（VLDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等。（3）患者CETP基因-629C/A多態(tài)的各基因型分布檢測(cè)。①PCR擴(kuò)增含-629C/A多態(tài)位點(diǎn)的基因片段：引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[9]，并由上海生工生物工程公司（Sangon）合成。上游引物：5-TTCTTGGCCCCAGCTGTAGG-3，下游引物：5-GAAACAGTCCTCTATGTAGACTTTCCTTGATATGCATAAAATACCACTGG-3。PCR反應(yīng)體系25 μL：5×PCR Buffer（內(nèi)含Mg2+）5 μL、DNA Polymerase（由寶生物工程有限公司生產(chǎn)）0.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各0.25 μL（初濃度0.3 μmol/L）、以及滅菌水16 μL。聚合酶鏈反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度為222 bp。②-629C/A多態(tài)的PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析：用限制性內(nèi)切酶Van91Ⅰ酶切包含-629C/A多態(tài)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)溫度37℃，酶切時(shí)間為4 h[8]。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳時(shí)間40 min，分子量參照標(biāo)準(zhǔn)為DL-2000 DNA marker，患者基因型由凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果確定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 18.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料分析 265例患者均為漢族人，其中男143例，女122例;平均年齡（59.61±10.43）歲;身體質(zhì)量指數(shù)（28.53±3.21）kg/m2，高血壓87例，吸煙96例。

2.2 治療前后患者的血脂水平比較 治療后，患者的TG、TC、LDL-C、VLDL-C水平均低于治療前，HDL-C水平高于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.3 等位基因頻率與基因型頻率分析 在本項(xiàng)研究結(jié)果中，-629C/A多態(tài)C等位基因頻率為55.1%，其中CC基因型患者74例，CA基因型患者144例，AA基因型患者47例，以上三種基因型頻率分別為27.9%、54.3%和17.7%。C等位基因頻率=（CC基因型例數(shù)×2+CA基因型例數(shù)）/（總例數(shù)×2）。

2.4 辛伐他汀治療后各血脂水平變化量在-629C/A各基因型患者間的比較 治療后，各基因型LDL-C變化量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中AA和CA基因型LDL-C變化量下降幅度均多于CC型（P<0.05）;其余指標(biāo)變化量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.5 RFLP結(jié)果分析 經(jīng)Van91Ⅰ酶切含-629C/A多態(tài)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段，其酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果為：CC基因型為222bp一個(gè)條帶;CA基因型為三個(gè)條帶，分別為222、175、47 bp（該片段小，可能跑出凝膠故未能在圖顯示）;AA基因型為兩個(gè)條帶，分別為175、47 bp（圖中未能顯示），見(jiàn)圖1。

3 討論

他汀類(lèi)藥物通過(guò)抑制HMG-CoA還原酶的活性，降低體內(nèi)膽固醇的合成，并能促進(jìn)機(jī)體血液內(nèi)LDL-C、VLDL-C的清除，因此在臨床上作為高脂血癥患者常用的調(diào)脂類(lèi)藥物，但流行病學(xué)研究顯示，他汀類(lèi)藥物的調(diào)脂療效存在著個(gè)體差異性[10-11]。作為影響血漿脂蛋白代謝的關(guān)鍵蛋白，CETP基因的多態(tài)性可能與他汀類(lèi)藥物的調(diào)脂效果相關(guān)聯(lián)[12-14]。

-629C/A多態(tài)是CETP基因中一個(gè)功能性多態(tài)，且多項(xiàng)研究結(jié)果表明，-629C等位基因攜帶者血漿CETP的活性和濃度，都要比AA基因型個(gè)體的明顯升高[15-17]。有研究結(jié)果顯示，-629A等位基因能與核轉(zhuǎn)錄因子Sp1/Sp3特異性結(jié)合，從而使得-629C/A多態(tài)能夠影響CETP基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響血漿脂蛋白的水平[18-19]，因此-629C/A多態(tài)可能影響辛伐他汀對(duì)血脂異常患者的調(diào)脂療效。

本研究對(duì)象中的-629C等位基因的頻率為55.1%，其中CC、CA、AA三種基因型頻率分別為27.9%、54.3%和17.7%;治療后，各基因型LDL-C變化量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中AA和CA基因型LDL-C變化量下降幅度均多于CC型（P<0.05）。該結(jié)果表明，-629C/A多態(tài)與辛伐他汀的調(diào)脂療效有關(guān)聯(lián)，并且提示-629A等位基因攜帶者對(duì)辛伐他汀的調(diào)血脂效果要更為敏感。

Gao等[8]研究中，-629CC基因型患者對(duì)阿托伐他汀調(diào)血脂效果最敏感，即LDL-C水平在-629CC基因型患者下降最明顯。這與本研究結(jié)論相反，造成這兩種結(jié)論的差異，可能與受試患者選擇不同有關(guān)（本研究選擇血脂異常為受試患者，而Gao等選擇的是冠心病患者），另外一個(gè)重要的因素是受試者經(jīng)他汀類(lèi)藥物治療的時(shí)間也不相同。

綜上所述，CETP基因-629C/A多態(tài)與辛伐他汀對(duì)血脂異常患者的調(diào)脂療效有關(guān)聯(lián)，但本項(xiàng)研究結(jié)果也存在一定的局限，例如選擇的CETP基因多態(tài)位點(diǎn)少，采集樣本量的不多，另外缺乏對(duì)照組實(shí)驗(yàn)等因素，都可能使得本結(jié)論存在一定的偏差，故對(duì)本項(xiàng)研究結(jié)論的解釋?xiě)?yīng)充分考慮這些因素。

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（收稿日期：2018-08-16） （本文編輯：董悅）