Myogenin 在不同發育階段小鼠骨骼肌中的表達差異

任華偉，薛霖莉，2，曹 靖，李藝雷，冀云燕，羅小毛，于秀菊，赫曉燕，王海東

（1.山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801；2.山西農業大學信息學院，山西太谷030800；3.北京農業職業學院畜牧獸醫系，北京102442）

MyoD 家族是近年來分子生物領域的研究熱點和前沿，目前已知成員包括MyoD、Myogenin、Myf5、Myf6。MyoD 家族成員的氨基酸序列的同源性高達80%，它們都有68 個殘基的同源片段[1-3]；其可激活靜止狀態的肌肉特有基因，并與增強子結合進而促進轉錄、促進某些細胞向骨骼肌分化[4]。不僅是骨骼肌的生長發育，在骨骼肌受損后肌纖維的修復過程中該家族也起著重要作用。

Myogenin 是MyoD 家族中的重要成員之一，在敲除Myogenin 基因的研究中，小鼠肌組織生成的成肌細胞數量不會改變，但其卻不能分化為肌細胞[5-6]，說明成肌細胞向成熟肌纖維分化過程中Myogenin起了主導作用。

NCVILLLC 等[7]在去神經造成的骨骼肌MRFS基因轉錄增強效果的試驗研究中發現，Myogenin 基因的反應很快并且增幅很高，其為MyoD 家族中在全部骨骼肌的細胞系中均能表達的唯一成員。HASTT 等[8]在小鼠Myogenin 蛋白消除試驗中表明，Myogenin 蛋白在肌細胞的分化過程中起主要調控的作用，是骨骼肌分化的必需因子，其作用不能被其他肌源性調節因子所代替。有研究結果表明，在力竭游泳實驗恢復的不同時期及肌肉損傷后的不同時期，骨骼肌成肌調節因子Myogenin 蛋白表達呈現規律性變化[9]，表明Myogenin 因子在此過程中具有重要的作用，可作為一項重要的醫學觀測指標，因此研究其在不同月齡小鼠的骨骼肌中的表達在治療肌肉疾病中具有重要的意義。此前，有學者研究Myogenin 基因在五指山豬與長白豬骨骼肌當中的表達對肉豬發育產量的影響，結果表明，Myogenin 基因不但影響骨骼肌表達的特異表型，而且還會對豬肉的產量和品質造成顯著影響[10]。TE 等[11]對14 199 個樣本Myogenin 基因3′端進行檢測發現，Myogenin 基因型對初生質量、日增質量、酮體質量及瘦肉率具有明顯的影響。對Myogenin 基因的深入研究將有助于推動當前養殖行業的發展與進步。

基于此前學者對Myogenin 的研究進展發現，有關動物機體肌肉發育與該基因表達變化之間的關系目前尚無人研究。

本試驗以處于幼年、性成熟、體成熟以及老年4 個不同發育階段的小鼠為研究對象，通過采用H.E.染色、組織化學免疫技術及熒光定量PCR 技術研究Myogenin 基因在小鼠骨骼肌中的表達差異，旨在對之后進一步研究動物骨骼肌生長發育機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

隨機選取品系為C57BL/6J 的健康小鼠（購于北京維通利華實驗動物技術有限公司），包含1 周齡幼鼠、3～4 周齡性成熟小鼠、6～8 周齡體成熟小鼠和8 月齡老年鼠各3 只。采用斷頸法處死小鼠，分別取其兩側骨骼肌，其中，左側采用Bouin's固定液進行固定，24 h 后采用梯度酒精和二甲苯進行脫水透明，制作成厚度為6 μm 的組織切片用作之后H.E.的染色和免疫組織化學試驗；右側即刻置于液氮內進行冷凍保存，用作提取總RNA 以及總蛋白。

1.2 試劑與儀器

試驗所用試劑和儀器列于表1。

表1 試驗試劑及試驗儀器

1.3 試驗方法

1.3.1 H.E.染色 將不同生長周期小鼠的骨骼肌組織塊用Bouin's 液固定后處理并切片，利用二甲苯和由高到低的梯度酒精脫蠟，蘇木精染核40 s 后用蒸餾水返藍，用由低到高梯度酒精脫水至90%，利用伊紅進行細胞質著色5～10 s，光學顯微鏡下觀察染色情況，繼續脫水至無水酒精，并用二甲苯進行組織透明，最后中性樹脂封片。

1.3.2 免疫組織化學試驗 將幼年、性成熟、體成熟和老年小鼠骨骼肌的石蠟切片用二甲苯和梯度酒精脫蠟處理，在組織上滴加solution A，37 ℃恒溫箱反應10 min 封閉內源性過氧化物酶；使用PBS緩沖液沖洗3 次；滴加封閉液solution B，然后置于恒溫箱10 min；陽性滴加一抗（MyoG 抗體和PBS 緩沖液以1∶30 比例配制），陰性滴加PBS 對照，4 ℃孵育14 h 后，37 ℃恒溫箱復溫30 min，用PBS 緩沖液沖洗3 次，濾紙吸去切片組織周圍液體，滴加二抗（solution C），恒溫箱中靜置孵育30 min；同樣濾紙吸去組織周圍液體，滴加solution D，恒溫箱中反應10 min，用PBS 緩沖液沖洗3 次，濾紙吸去組織周圍液體，滴加DAB 顯色劑，保持避光，當觀察到組織變色并不再加深時，用PBS 沖洗3 次，用蘇木精染核3 min，蒸餾水沖洗3 次。使用梯度酒精和二甲苯脫水透明，最后用中性樹脂進行封片。

1.3.3 總RNA 的提取 在液氮條件下快速將組織塊研磨成粉末并移入1 mL 的Trizol 裂解液中混勻。加入200 μL 氯仿，混合至溶液呈現乳粉色，冰上靜置5 min，12 000 g 4 ℃離心15 min 可見溶液分層，上層為含有RNA 的無色上清水樣層，中層含有白色蛋白質和DNA，下層為帶有顏色的有機相。緩慢吸取上清液移入新離心管中，加入500 μL 異丙醇，混勻后冰上靜置10 min，12 000 g 4 ℃離心10 min，棄上清，加入1 mL 的70%冰乙醇上下顛倒充分洗滌離心管管壁，7 500 g 4 ℃離心5 min 后盡量棄去上清液，小心吸去殘液并快速干燥幾分鐘，用適量的DEPC 水溶解RNA 沉淀，離心混勻后用核酸濃度檢測儀測定總RNA 濃度以及OD260/OD280值。

1.3.4 反轉錄 將提取的總RNA 稀釋至1 000 ng/μL 備用，通過2 步法進行反轉錄：第1 步，去除基因組DNA。加入2 μL 5×g DNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser 和1 μL RNA 樣品，RNAse Free H2O 補充至10 μL體系，PCR 儀中42 ℃反應2 min。第2 步，反轉錄，基于第1 步反應體系，加入1μL 的Rrime Scripe RTEnzyme MixⅠ、1 μL 的RT Rrime mix、4 μL的5×prime scripe Buffer 2 以及4 μL RNAse Free H2O 將體系補充至20 μL，PCR 儀中37 ℃15 min、85 ℃5 s。反應結束后，測定cDNA 濃度，并稀釋至100 ng/μL 備用。

1.3.5 普通PCR 通過普通PCR 測定目的Myogenin 引物的最適擴增溫度，其體系列于表2。

表2 普通PCR 體系（10 μL）

設置8 個溫度梯度：53，54，55，56，57，58，59，60 ℃。梯度PCR 儀設置變性、退火、延伸3 個環節，共擴增40 個循環，反應條件為：95 ℃起始5 min；95 ℃變性30 s，53～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s；72 ℃終延伸5 min。120 V 電壓進行瓊脂糖凝膠電泳20 min，通過紫外透視儀和相應軟件AlphaEase-FC 觀察比對，從而確定Myogenin 引物的最佳退火溫度。

1.3.6 實時熒光定量PCR 根據GenBank 錄入的Myogenin 基因序列的保守區域，運用Primer 5.0 軟件設計小鼠Myogenin 基因的特異性引物以及內參引物β-Actin（華大基因公司合成），引物序列列于表3。通過實時熒光定量PCR 檢測，對起始模板進行定量和定性分析，反應體系列于表4。

表3 目的基因及內參基因引物序列

表4 熒光定量PCR 體系（10 μL）

2 結果與分析

2.1 不同發育階段小鼠骨骼肌的形態特征

H.E.染色的切片在光學顯微鏡下進行觀察并拍照，結果發現，幼年期與性成熟時期的小鼠骨骼肌細胞間隙較小，肌纖維排列緊密，年齡越小的小鼠骨骼肌細胞胞核越多，并且多見中央核，隨著年齡的增長，老年小鼠的肌細胞間隙明顯增寬，肌纖維排列疏松，肌束間隙明顯增大，細胞核稀少并逐漸邊緣化（圖1）。

2.2 不同發育階段小鼠骨骼肌中Myogenin 的表達定位

將免疫組織化學切片放置在顯微鏡下觀察并拍照，可見滴加一抗的陽性組與陰性組有明顯不同，其中，陽性組細胞胞核呈現藍紫色，其胞質有明顯黃染；陰性組骨骼肌組織未見此反應。通過免疫組織化學染色可以看出，Myogenin 在小鼠骨骼肌的4 個發育階段均有表達，且在幼年和性成熟時期表達量較體成熟期和老年時期要高，其表達位置為細胞質（圖2）。

2.3 Myogenin mRNA 在不同發育階段小鼠骨骼肌中的表達差異分析

2.3.1 Myogenin 在不同發育階段小鼠骨骼肌中的表達 提取出的總RNA 經過DEPC 水溶解后用核酸濃度檢測儀進行監測，其結果列于表5。

表5 總RNA 的濃度及OD260/OD280 值

經過PCR 儀將RNA 反轉錄為cDNA 后，用核酸濃度檢測儀測定cDNA 的濃度，其結果列于表6。

表6 cDNA 的濃度及OD260/OD280 比值

根據瓊脂糖凝膠電泳試驗結果（圖3），第8 條帶清晰明顯，并且無拖尾現象，可以確定Myogenin的最佳退火溫度為60 ℃。

2.3.2 Myogenin mRNA 在不同發育階段小鼠骨骼肌中的表達差異 根據Myogenin 基因和內參基因的溶解曲線可知（圖4），該定量PCR 結果具有特異性，從擴增曲線來看，目的基因從第24 個循環開始擴增，內參基因從第14 個循環開始擴增，在擴增過程中有較為一致的上升期和平臺期，根據該曲線得出的CT 值，由2-ΔΔCT法計算出目的和內參基因在不同發育階段小鼠骨骼肌中的相對表達水平，結果顯示，體成熟和老年小鼠骨骼肌組織中Myogenin 的表達量與幼年小鼠相比呈現極顯著差異（P＜0.01），隨著小鼠發育成熟，Myogenin 在小鼠骨骼肌組織中表達水平基本呈現下降趨勢，幼鼠表達量極高，老年鼠表達量最低，表明Myogenin 與骨骼肌的成熟發育相關（圖5）。

3 結論和討論

骨骼肌是由具有收縮能力的肌細胞組成，它是動物機體中最大的肌肉組織、不分支，并且有明顯的橫紋。隨著分子生物學的發展及基因敲除技術和基因打靶技術的進步，人們對骨骼肌的生長與發育在分子水平上有了更加深入的了解[12-14]。有后肢懸垂對Myogenin 基因影響的研究[15]、運動狀態對Myogenin 的影響研究[16]；曾纓等[17]研究認為，Myogenin 基因在不同月齡的DMD 模型鼠身上的表達，Myogenin 在1 月齡的mdx 小鼠身上表達最強烈，13 月齡仍有表達，但正常C57 鼠幾乎不表達[17]。這些研究表明，Myogenin 基因表達量不僅與其運動狀態、病理狀況、張應力及乙酰膽堿刺激等影響有關，更與機體的發育階段相關。

本試驗分別提取了幼年時期、性成熟時期、體成熟時期以及老年時期4 個有代表性的不同發育階段小鼠骨骼肌組織，通過H.E.染色、免疫組化及定量PCR 觀察Myogenin 基因的表達水平。有學者研究生長激素對骨骼肌細胞形態的影響，在注射生長激素8 周后，骨骼肌纖維排列松散，細胞核數量減少且體積變小[18]。通過H.E.染色的切片結果可以看出，肌肉由數量不等的肌束構成，H.E.染色切片空白的間隙即為肌束膜，是由含有血管和神經的結締組織構成。通過不同發育階段的小鼠腓腸肌H.E.染色切片對比可以看出，幼年和性成熟時期的肌束間隙比較小，肌束較為緊密，而體成熟和老年時期的骨骼肌肌束稀少并且間隙比較寬大，細胞核數目也明顯減少，研究結果與前人研究結果吻合。廖艷萍[19]對發育期小鼠大強度離心運動對Myogenin 基因表達影響的研究表明，該基因在幼年期小鼠骨骼肌有表達，達雨等[20]對功能矯形對青春期小鼠Myogenin 表達影響的研究表明，該基因在性成熟及體成熟時期有表達。本試驗通過免疫組織化學試驗的切片可以看出，Myogenin 基因在4 個不同的發育階段均有表達，說明Myogenin 基因貫穿了動物體發育的一生，是骨骼肌發育所必需的，與其結論基本一致。有試驗表明，Myogenin 基因表達與動物年齡有關，孫偉等[21]對Myogenin 基因不同日齡的湖羊背最長肌中的表達進行研究，結果發現，年齡對Myogenin 基因在湖羊背最長肌中的表達有顯著影響，且幼年的湖羊Myogenin 基因表達量最高。通過定量PCR 試驗結果可以看出，Myogenin 基因在幼年時期表達量極高，與其他發育時期相比具有顯著差異。表明肌肉在幼年時期發育分化最快，與已有研究結果基本一致。小鼠骨骼肌Myogenin 的表達量與其發育時期密切相關，且在幼年時期表達量最高。

本研究結果表明，Myogenin 基因在幼年、性成熟、體成熟和老年時期4 個階段的小鼠骨骼肌中均有表達，且表達位置是細胞質。Myogenin 基因在這4 個階段的表達量具有顯著差異，且在幼年時期小鼠骨骼肌的表達量極高，在性成熟時期小鼠骨骼肌中的表達量減少不明顯，而在體成熟期和老年時期小鼠骨骼肌中的表達量顯著減少。