超聲輔助提取金耳香豆素的工藝優(yōu)化

牛四坤

（山西藥科職業(yè)學院藥學系，山西太原030031）

金耳，學名金木耳（Tremella aurantialba），屬于擔子菌綱銀耳屬，是一種珍貴的藥用和食用菌類。野生金耳非常稀有，金耳種植會受到季節(jié)、場地的影響，且金耳種植產品質量不夠穩(wěn)定，所以目前金耳的液體發(fā)酵成為一種有前景的金耳菌生產方式，菌絲體液體發(fā)酵不受季節(jié)限制，節(jié)約場地，金耳菌絲體質量穩(wěn)定性好，生產效率高，其菌絲體營養(yǎng)成分與子實體基本相同[1]。近年來，藥理學研究表明，金耳具有抗上呼吸道感染、抗冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、消炎解毒、抗凝血抗血栓的作用[2-3]。前期研究表明，金耳抗凝血的活性成分主要為香豆素類化合物，并以香豆素含量為評價指標對其提取工藝進行了研究，但該工藝能耗高、時間長、操作繁瑣、香豆素類成分易被破壞。

本研究基于超聲波提取技術具有快速簡便、價廉、高效、不易破壞天然活性成分等優(yōu)點[4-5]，以超聲輔助提取法對金耳香豆素提取工藝進行了優(yōu)化研究，以期為今后金耳菌絲體作為保健食品或藥品提供成分分析研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器及試劑

1.1.1 材料 供試金耳菌絲體由山西省生物研究所金耳9800 菌種發(fā)酵制得，批號（20170511）。

1.1.2 試劑及儀器 補骨脂素標準品（由中國藥品生物制品檢定所提供）；甲醇（北京北化精細化學品有限責任公司）；無水乙醇（AR）。旋轉蒸發(fā)儀RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）；紫外-可見分光光度計（SHIMADZU UV-1601PC）；超聲波清洗器KS-120D（寧波海曙科聲超聲設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 金耳菌絲體總香豆素提取工藝[6]金耳菌絲體（濕）→清洗→烘干→粉碎→稱取適量金耳菌絲體（干）→超聲波醇提取→減壓過濾→去除濾渣→取濾液。

1.2.2 金耳香豆素測定[7-8]

1.2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取補骨脂素標準品6.3 mg 于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，再精密吸取1 mL 至容量瓶中，甲醇定容至50 mL，制得對照品溶液。

1.2.2.2 標準曲線的繪制[9]分別精密量取補骨脂素對照品溶液1，3，5，7，10 mL 置各容量瓶中，用甲醇定容至10 mL。以甲醇為空白對照，在245 nm 處測定吸光度（A）。以吸光度（A）為縱坐標、補骨脂素濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A＝0.007 6＋0.112 1C（r＝0.999 7，n＝5）。試驗表明，補骨脂素對照品濃度在0.504 0～5.040 0 μg/mL 范圍內與吸光度成線性關系。

1.2.2.3 樣品香豆素測定 精密量取超聲輔助提取液1 mL 置于100 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算金耳總香豆素濃度及提取率。

1.2.2.4 金耳總香豆素提取率計算 總香豆素提取率＝樣品提取液濃度×體積×稀釋倍數(shù)/原料質量×100%。

1.2.3 金耳菌絲體香豆素提取工藝的優(yōu)化 選取液料比、超聲功率、超聲時間、乙醇濃度4 個因素進行單因素試驗，根據(jù)4 個因素的最優(yōu)試驗范圍，以總香豆素提取率作為優(yōu)化指標，采用正交試驗對金耳香豆素提取工藝進行優(yōu)化。

1.3 數(shù)據(jù)處理[10]

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016 和SPSS 22 軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對金耳香豆素提取率的影響[11]準確稱取金耳菌絲體干粉5 g，分別用30%，40%，50%，60%，70%和80%的乙醇對金耳菌絲體香豆素進行超聲提取，考察乙醇濃度對提取率的影響情況。從圖1 可以看出，隨乙醇濃度的增加，金耳香豆素提取率先上升后下降，當乙醇濃度為50%時，金耳香豆素提取率達0.76%，為最高，這是由于50%乙醇的極性與金耳香豆素極性相近，因此，根據(jù)相似相溶原理，50%的乙醇對金耳香豆素的提取效果較好。

2.1.2 液料比對金耳香豆素提取率的影響[12]準確稱取金耳菌絲體干粉5 g，分別用5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1 和30∶1（mL/g）的液料比對金耳香豆素進行提取，觀察金耳香豆素的提取率。由圖2 可知，在液料比為5∶1～20∶1（mL/g）范圍內，隨著乙醇用量的增大，金耳香豆素提取率也逐漸升高，當液料比大于20∶1時，提取率變化不大，這是因為當提取溶劑用量大到一定程度后，會增加超聲波破碎細胞的阻力，一定程度上降低了金耳香豆素的提取率[11]，此時滲透壓的改變不足以提高香豆素的提取率，同時考慮到成本及試劑回收的難度，選取20∶1為最佳液料比，此時金耳香豆素提取率最大，為0.74%。

2.1.3 超聲波功率對金耳香豆素提取率的影響[13]準確稱取金耳菌絲體干粉5 g，分別采取100，150，200，250，300，350 W 的超聲波功率對金耳香豆素進行提取，考察超聲功率對金耳香豆素提取率的影響。從圖3 可以看出，超聲功率為100～200 W 時，隨著功率的增大，金耳香豆素的提取率也增加；當超聲功率在200～350 W 時，金耳香豆素提取率隨著超聲功率的增大而逐漸降低。另外，考慮到隨著超聲功率的增大，金耳菌絲體細胞內物質溶出增多，增加了后期提取液中香豆素類化合物的純化難度，確定較適宜的超聲功率為200 W，此時金耳香豆素提取率為0.71%，提取率較高。

2.1.4 超聲波提取時間對金耳香豆素提取率的影響[14]準確稱取金耳菌絲體干粉5 g，分別采用20，30，40，50，60，70 min 的超聲波提取時間對金耳菌絲體進行處理，以考察超聲波提取時間與香豆素提取率的關系。從圖4 可以看出，金耳香豆素提取率隨著提取時間的延長在不斷提高，隨著提取液中香豆素含量的增加，再加上金耳菌絲體中香豆素的量逐漸減少，從而使得提取液中金耳香豆素含量增長減緩。當提取時間超過50 min 后，金耳香豆素提取率變化不大，為0.70%。考慮到時間成本及香豆素類化合物的破壞因素，提取時間50 min 較為適宜。

2.2 金耳香豆素提取工藝的優(yōu)化[15-16]

在單因素試驗的基礎上，分別選取液料比15∶1，20∶1，25∶1（mL/g），超聲波功率150，200，250 W，乙醇濃度40%，50%和60%，超聲波提取時間40，50，60 min，利用正交試驗對金耳香豆素的超聲醇提取工藝進行優(yōu)化。正交試驗因素水平設計列于表1，正交試驗結果列于表2。

表1 因素水平

表2 正交試驗直觀分析結果

表3 方差分析結果

從表2 可以看出，提取金耳香豆素的各因素主次順序為A＞B＞D＞C，即乙醇濃度＞液料比＞超聲功率＞超聲時間。金耳香豆素的提取工藝條件最優(yōu)組合為A2B3C1D2，即乙醇濃度為50%，液料比為25∶1，超聲波提取時間為40 min，超聲波功率為200 W，在此條件下，金耳香豆素的提取率達到0.85%。將試驗結果進行方差分析，其結果列于表3。從表3 可以看出，乙醇濃度對金耳香豆素提取率影響顯著，其他3 個因素液料比、超聲時間、超聲功率對金耳香豆素提取率影響不顯著。

3 結論

考慮到溶劑毒性、成本及乙醇良好提取特性，選擇乙醇作為為提取溶劑[17-18]，采用超聲輔助提取，本研究通過單因素試驗考察各提取因素對金耳香豆素的影響，利用正交試驗對工藝條件進行優(yōu)化，得出了金耳菌絲體總香豆素最佳提取工藝條件：采取50%乙醇、液料比25∶1、超聲提取時間40 min、超聲功率200 W，在此條件下，金耳菌絲體總香豆素的提取率達到0.85%。與傳統(tǒng)醇提取法相比，超聲波輔助提取耗時短、能耗低、提取率高且不易破壞提取物活性[19-20]，因此，其可用于金耳菌絲體香豆素的提取。該結果可為今后金耳菌絲體化學成分的進一步研究奠定基礎。