小麥矮稈突變體DC20的轉(zhuǎn)錄組分析

劉 晴 古佳玉 趙紫偉 趙林姝 郭會君 謝永盾 宋希云 劉錄祥,?

(1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東青島 266109;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程/國家農(nóng)作物航天誘變技術(shù)改良中心,北京 100081)

研究表明,降低株高是矮稈基因功能的具體體現(xiàn),引起植株矮化的機(jī)制較復(fù)雜,涉及因素廣泛,其中植物激素在植物生長發(fā)育的不同階段發(fā)揮著重要作用[1]。六大類植物內(nèi)源激素中,生長素類(auxin,IAA)、赤霉素類(gibberellins,GAs)、細(xì)胞分裂素類(cytokinins,CTK)、油菜素甾醇類(brassinosteroids,BRs)屬于生長促進(jìn)劑,乙烯(ethylene)和脫落酸(abscisic acid,ABA)屬生長抑制劑[2-3]。不同激素的調(diào)節(jié)功能存在差異,如IAA 是最早發(fā)現(xiàn)的植物激素,其具有促進(jìn)營養(yǎng)生長過程中的胚芽鞘和莖生長,抑制根生長,維持頂端優(yōu)勢等生理作用[4]。GAs 為四環(huán)二萜類化合物,分為C19GAs 和C20GAs 兩大類,目前已有超過136 種不同形式赤霉素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)被確定,如GA1、GA3等[5],其在種子萌發(fā)、節(jié)間伸長、開花、結(jié)實等生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[6-10],且GAs 對莖稈伸長的調(diào)節(jié)作用效果顯著[11-12],因此植物體內(nèi)活性GAs 含量的動態(tài)平衡至關(guān)重要。ABA 作為生長抑制劑可通過阻止細(xì)胞壁酸化和細(xì)胞伸長,進(jìn)而抑制胚芽鞘、胚軸、嫩枝等器官的伸長生長[13]。

此外,植物體中各激素間存在交互作用,如GA3能促進(jìn)內(nèi)源IAA 含量提高,同時使用GA3和IAA 較單一激素更能顯著促進(jìn)植物節(jié)間伸長[14-15]。研究表明,當(dāng)GAs 或BR 的信號傳導(dǎo)受阻或生物合成受到抑制時,植株表現(xiàn)為矮化[1];蔡鵬[16]研究發(fā)現(xiàn)IAA 或某些基因的不正常表達(dá)也會導(dǎo)致少數(shù)植株矮化。前人通過研究與激素代謝密切相關(guān)的矮化突變體,明確了基因突變是致矮的主要因素。此外,研究發(fā)現(xiàn)GAs、IAA、BR 等激素合成相關(guān)基因的突變會導(dǎo)致植物體內(nèi)源激素動態(tài)平衡紊亂以及激素信號傳導(dǎo)發(fā)生突變,中斷正常信號通路會導(dǎo)致植株矮化[1]。

小麥(Triticum aestivum L.)作為世界三大主要糧食作物之一,其產(chǎn)量和消費量約占世界谷物的30%,貿(mào)易量約占世界谷物的45%,株高是決定小麥產(chǎn)量的重要因素,矮稈抗倒伏是小麥育種的主要目標(biāo)性狀之一[17]。目前小麥矮稈基因較單一化且遺傳背景狹隘,僅有農(nóng)林10 號的Rht-B1b、Rht-D1b 和赤小麥的Rht8在育種中被廣泛利用,小麥產(chǎn)量和育成品種的遺傳多樣性不能滿足考種需求[18]。因此,發(fā)掘新的矮稈基因和矮源材料是當(dāng)前小麥矮化育種的主要目標(biāo)。

育種過程中常用的矮稈基因大多是通過自發(fā)突變和物理或化學(xué)誘發(fā)突變產(chǎn)生。誘發(fā)突變技術(shù)通過提高誘變率,誘發(fā)產(chǎn)生自然界稀有或一般方法較難獲得的新類型、新性狀或新基因,加速育種進(jìn)程,為選育突破性新品種創(chuàng)造條件[19]。據(jù)不完全統(tǒng)計,全世界已通過物理、化學(xué)等誘變技術(shù),在糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、蔬菜、花卉等164 種植物上育成2 500 多個突變品種和數(shù)萬份突變資源[20]。突變體DC20 是D6-3(wide type,WT)經(jīng)北京正負(fù)電子對撞機(jī)實驗室通過高能混合粒子束模擬次級宇宙射線,構(gòu)成高能混合粒子輻射場處理后選育獲得的株高穩(wěn)定降低、植株株型緊湊、抗倒伏、豐產(chǎn)性能好,而產(chǎn)量與WT 無差異的矮稈植株。

轉(zhuǎn)錄組是特定生理或發(fā)育階段條件下,細(xì)胞整套轉(zhuǎn)錄本的集合,通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,不僅能挖掘到基因組功能要素,而且可以揭示組織或細(xì)胞內(nèi)分子成分與生物學(xué)進(jìn)程,進(jìn)而闡釋植物的發(fā)育與病理機(jī)理[21]。目前RNA-Seq 數(shù)據(jù)分析在研究植物特異突變、特定發(fā)育時期、生物與非生物脅迫等方面應(yīng)用廣泛,如曹樺等[22]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析研究了鐵皮石斛葉色突變體的形成機(jī)理,但目前關(guān)于小麥矮稈突變體轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究報道尚不常見。本研究通過對矮稈突變體DC20 及其WT 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序與比較分析,篩選差異表達(dá)基因,以期為小麥突變體DC20 矮化的分子機(jī)理研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

矮稈突變體DC20 是高稈親本D6-3(WT)經(jīng)185 Gy 的高能混合粒子場處理篩選所得。突變體DC20和WT 于2013年10月均種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所中圃場實驗基地,行長2 m,行距30 cm,株距6 cm,常規(guī)田間管理,DC20(62.13 cm)成熟期的株高較WT(76.35 cm)極顯著下降了18.6%。

圖1 野生型(WT)與突變體DC20 株高表型性狀Fig.1 Phenotypic trait of plant height from wild type(WT)and the mutant DC20

取孕穗期的WT 和突變體DC20 莖稈材料,各樣品均設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù),取樣后立即置于液氮中并在研缽中充分研磨至粉末狀,準(zhǔn)確稱取50.0 mg 干粉置于2.0 mL 的硬質(zhì)塑料管中(AXYGEN,USA),-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 文庫的構(gòu)建和測序 按照plus 植物總RNA 提取試劑盒[天根生化(北京)科技有限公司]操作說明書提取RNA。分別用Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計(美國賽默飛世爾有限公司)、1%瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 芯片生物分析儀(美國安捷科技有限公司)檢測RNA 的濃度和完整性。1.9 ≤OD260/OD280≤2.1;OD260/OD230≥1.8;RIN≥6.5 被認(rèn)為是質(zhì)量合格的樣品,可用于文庫的構(gòu)建。按照Illumina Gene Expression Sample Prep Kit(百邁客生物科技有限公司)說明書構(gòu)建cDNA 文庫并進(jìn)行質(zhì)控檢測,然后用Illumina HiSeqTM2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組雙端測序。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 使用In-house perl 腳本處理測序產(chǎn)出的原始數(shù)據(jù),去除含有接頭、poly-N 及低質(zhì)量reads 后獲得高質(zhì)量clean reads(有效讀長),并對Q20、Q30、GC 含量以及重復(fù)序列水平進(jìn)行統(tǒng)計;將上述高質(zhì)量clean reads 與小麥中國春參考基因組(IWGSC1_popseq.31 版本)進(jìn)行比對,應(yīng)用Tophat2 工具進(jìn)行精準(zhǔn)匹配,達(dá)到100%匹配或僅有1 個堿基錯配的reads,才可用于后續(xù)功能注釋分析。使用BLAST軟件(Version 2.2.26)將獲得的通用基因(Unigene)序列與NCBI non-redundant protein sequences (NR)、Protein family ( Pfam )、UniProt/Swiss-Prot、Gene Ontology(GO,http：/ /www.geneontology.org)、Clusters of Orthologous Groups of proteins(KOG/COG,http：/ /www.ncbi.nlm.nih gov/COG/)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG,http：/ /www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,并根據(jù)基因在不同樣品或樣品組中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)基因功能注釋的分析。

1.2.3 激素含量的測定 將冷凍莖稈干粉樣品送至北京林業(yè)大學(xué)化學(xué)實驗室,采用LC-MS/MS 法檢測孕穗期WT 和DC20 莖稈內(nèi)激素GA1、GA3、IAA 和ABA的含量,利用Logit 曲線換算激素濃度(ng·mL-1)后,再計算各樣品激素含量(ng·g-1FW)。

式中,Logit 表示各濃度顯色值,B 代表各濃度的顯色值,B0代表0 ng·mL-1孔的顯色值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

通過FPKM 數(shù)值對基因表達(dá)水平進(jìn)行定量分析,對有生物學(xué)重復(fù)的樣品, 利用DEGseq R 軟件(1.10.1)進(jìn)行差異表達(dá)分析統(tǒng)計,本研究中閾值為Pvalue≤0.01 和|log2fold changes|≥1 的基因即為顯著差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.1.1 基因組裝分析 利用Illumina HiSeq 高通量測序平臺對已構(gòu)建好的6 個cDNA 文庫進(jìn)行測序,產(chǎn)出22 300 297～37 909 000 不同數(shù)目的clean reads;每組材料的GC 含量均基本呈隨機(jī)分布且無偏差;通常質(zhì)量控制參數(shù)Q30＞80%表示測序質(zhì)量非常可靠,本試驗中Q30＞86.56%表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量高,建庫理想。將匹配上的reads 使用Trinity 進(jìn)行組裝,將其在各大數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基因功能注釋,發(fā)現(xiàn)所有的Unigenes 在COG、GO、KEGG、Swiss-Prot、NR 中注釋條目較多,且長度分布在1 000 bp 以上,表明測序產(chǎn)出質(zhì)量較高,所得基因功能注釋條目數(shù)較多,可用于后續(xù)矮稈突變體中差異表達(dá)基因的挖掘及對矮化分子機(jī)制的相關(guān)代謝途徑的探討。

2.1.2 差異表達(dá)基因統(tǒng)計分析 將WT 與突變體DC20 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,通過FPKM 值和以|log2fold changes|≥1,閾值P-value≤0.01 為篩選條件查找差異表達(dá)基因并進(jìn)行聚類分析。由圖2 可知,WT與DC20 間的差異基因有2 153 個(上調(diào)基因425 個,下調(diào)基因1 728 個)。

圖2 分組差異表達(dá)基因聚類分析Fig.2 The cluster of differentially expressed genes in different groups

2.1.3 差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析 對差異表達(dá)基因在各個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋,GO 富集表明差異基因主要集中在細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)(80.63%)、新陳代謝(metabolic term)(72.73%)、單一生物進(jìn)程(single-organism process)(73.77%)、刺激反應(yīng)(response to stimulus) (57.39%)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)(48.61%)及其他信號傳遞、生長等生物學(xué)過程中;差異基因主要分布在細(xì)胞內(nèi)成分(intracellular components) (90.40%)、細(xì)胞(cell)(87.69%)、細(xì)胞器內(nèi)成分(cell component)(79.91%)以及膜成分(membrane component)(41.59%);分子功能主要包括結(jié)合(binding)(61.24%)和催化反應(yīng)活性(catalytic activity)(51.11%)等功能(圖3-A)。

由COG 注釋可知差異基因多集中在通用功能預(yù)測( general function prediction only, R ) ( 761,16.77%), DNA 復(fù)制、重組和修復(fù)( replication,recombination and repair,L)(458, 10.09%),轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制(transcription,K)(412,9.08%),信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(signal transduction mechanisms,T)(333,7.34%),轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白轉(zhuǎn)運與分子伴侶(posttranslational modification, protein turnover, chaperones,O) (296,6.52%),翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成(translation,ribosomal structure and biogenesis,J)(293,6.46%)和細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂、染色體分離(cell cycle control,cell division, chromosome partitioning,D)(201,4.43%)等功能條目上(圖3-B)。

KEGG 注釋表明,差異基因主要富集在苯丙酸生物合成( phenylpropionic acid biosynthesis) (145,11.09%)、淀粉和蔗糖的代謝(starch and sucrose metabolism) ( 88, 6.73%)、苯 丙 氨 酸 代 謝(phenylalanine metabolism)(88,6.73%)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction of plant hormones) (81,6.20%)等通路(圖3-C)。

圖3 WT 和DC20 間差異表達(dá)基因注釋分類統(tǒng)計圖Fig.3 The classifications of DEGs between WT and DC20

進(jìn)一步對差異基因進(jìn)行生物學(xué)進(jìn)程分析,發(fā)現(xiàn)植物激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction of plant hormones)和細(xì)胞分裂(cell division)、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)(cell growth regulation pathways)通路的所有基因均為下調(diào)(圖4)。

2.1.4 差異表達(dá)基因注釋數(shù)據(jù)挖掘分析 結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的通路信息,發(fā)現(xiàn)矮稈突變體DC20 中與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的差異基因幾乎都下調(diào)表達(dá)(表1)。

調(diào)取赤霉素合成通路所有已知合成酶基因與基因序列,與數(shù)據(jù)進(jìn)行比對,找到了CPS、KS、KO、KAO、GA20ox 相關(guān)基因。其中赤霉素生物合成途徑的早期合成酶基因CPS、KS、KO 的表達(dá)量均下調(diào),與內(nèi)源赤霉素含量下降的結(jié)果一致(表2)。GA20ox 是赤霉素合成通路中的主要反饋調(diào)控節(jié)點,在突變體DC20的轉(zhuǎn)錄組中GA20ox 的上調(diào)可能與反饋調(diào)控相關(guān)。

圖4 WT 和DC20 在不同細(xì)胞進(jìn)程中差異表達(dá)基因數(shù)Fig.4 The number of DEGs in different cellular processes between WT and DC20

2.2 激素含量分析

由表2 可知,WT 中各內(nèi)源激素含量均明顯高于DC20,其中WT 中GA1和IAA 含量顯著高于突變體DC20,WT 中的GA3含量極顯著高于DC20,WT 中的ABA 含量與DC20 差異不顯著,表明DC20 株高的降低可能與GAs 和IAA 含量降低有關(guān)。

表2 赤霉素合成途徑的差異表達(dá)基因Table 2 DEGs in gibberellin synthesis pathway

表3 小麥莖稈內(nèi)不同激素含量Table 3 Results of different hormone content in wheat stalk

3 討論

內(nèi)源激素作為植物體內(nèi)的“第一信使”,可介導(dǎo)植物體不同生長和發(fā)育過程,貫穿整個生命周期,對植物生長發(fā)育和生理活動調(diào)節(jié)具有重要作用[23]。在調(diào)節(jié)植物發(fā)育過程中,激素可通過調(diào)控細(xì)胞分裂和細(xì)胞長度達(dá)到控制株高的目的[24-25]。GH3 家族(GH3.1、GH3.2、GH3.5、GH3.6、GH3.17)編碼生長素酰胺合成酶,促使植物體內(nèi)冗余的IAA 與氨基酸結(jié)合形成IAA-氨基酸復(fù)合物,從而維持植物體內(nèi)IAA 的動態(tài)平衡,促進(jìn)植株生長發(fā)育[26-28]。而SAUR 基因的誘導(dǎo)表達(dá)抑制了植株生長,導(dǎo)致突變體呈現(xiàn)矮化表型[29]。IAA5是一類生長素快速響應(yīng)因子,具有生長調(diào)節(jié)作用[30]。本研究中突變體DC20 中的GH3、IAA 和AUX1 等生長促進(jìn)因子表達(dá)下調(diào),而抑制因子SAUR 表達(dá)上調(diào),表明生長素的動態(tài)平衡調(diào)節(jié)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,是影響細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞伸長的關(guān)鍵因素,與前人研究一致。

大量研究表明,GAs 生物合成酶基因的缺失可導(dǎo)致植株出現(xiàn)葉色加深、莖稈短粗、開花延遲等變異,施加外源GA3可部分恢復(fù)株高、花期等表型[31-32]。Yamaguchi 等[33]對擬南芥和水稻進(jìn)行研究,結(jié)果表明植物體內(nèi)源GAs 的生物合成途徑的早期合成酶包括古巴焦磷酸合酶(copalyl pyrophosphate synthase,CPS)、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶(kaurene synthase,KS)、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶(kaurene oxidase,KO)和內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶(kaurene acid oxidase,KAO)4 類。前體牻牛兒基二磷酸(geranylgeranyl pyrophosphat,GGDP)被上述4 類酶催化合成GAs 前體GA12,此生物途徑已在小麥中被鑒定[34-35]。本研究中突變體DC20的CPS、KS、KO 和KAO 的編碼基因均下調(diào)表達(dá),與激素鑒定中GA1和GA3含量降低的結(jié)果一致。擬南芥突變體ga1、ga2 和ga3 由于分別缺失了CPS、KS 和KO 活性,內(nèi)源GAs 合成停留在早期合成途徑,活性GAs 嚴(yán)重缺失,導(dǎo)致植株出現(xiàn)雄性不育和嚴(yán)重矮化的突變表型[36-38]。突變體DC20 中CPS、KS、KO 和KAO的編碼基因雖然都下調(diào)表達(dá),但內(nèi)源GA1和GA3的缺失并不嚴(yán)重,因此僅表現(xiàn)出半矮生的突變表型,育性幾乎不受影響。內(nèi)源GAs 生物合成途徑的晚期合成酶包括催化活性GAs 生成的GA20ox 和GA3ox,以及催化活性GAs 失活的GA2ox。晚期合成酶兼具反饋調(diào)控的功能,植物有機(jī)體通過抑制或激活其活性來調(diào)節(jié)內(nèi)源GAs 的動態(tài)平衡[39]。本研究中突變體DC20 內(nèi)源GA1和GA3含量降低,GA20ox 的上調(diào)表達(dá)正好符合反饋調(diào)控機(jī)制。由此可見,突變體DC20 的矮化表型與內(nèi)源GAs 的合成調(diào)控密切相關(guān),但是具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過運用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明,參與細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞伸長的差異表達(dá)基因在矮稈突變體DC20 中下調(diào)表達(dá);參與生長素動態(tài)平衡調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和赤霉素生物合成的基因在DC20 中下調(diào)表達(dá),相關(guān)抑制因子則上調(diào)表達(dá)。輻射誘變產(chǎn)生的突變,主要通過調(diào)控植物激素合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來影響細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞伸長,最終產(chǎn)生DC20 的矮化表型。下一步可對DC20 突變性狀基因進(jìn)行定位,并克隆該基因。本研究結(jié)果為闡明矮稈突變體形成的分子調(diào)控機(jī)理研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。