基于Label-free組學研究南極磷蝦油對脂代謝的影響

張迪雅 崔晨茜 何曉倩 李 曄 蘇秀榕

(寧波大學海洋學院,浙江寧波 315211)

南極磷蝦油中富含不飽和脂肪酸,其中二十碳五烯酸(eicosapntemacnioc acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid,DHA)含量高達15.86%,且主要以磷脂(phospholipids,PL)形式存在[1-2]。研究表明,以磷脂形式存在的EPA 和DHA 更易被生物體吸收[3-6]。南極磷蝦油具有調(diào)節(jié)脂肪代謝、降低血中總膽固醇和甘油三酯含量、清除過多脂質(zhì)的作用[7-8],如Zhu 等[9]通過比較正常大鼠和高脂血癥大鼠攝入磷蝦油后血脂的變化情況,發(fā)現(xiàn)南極磷蝦油具有降低高脂大鼠甘油三酯和膽固醇水平的功能;Lee 等[10]研究了南極磷蝦油對高脂飼料喂養(yǎng)下小鼠血脂的影響,發(fā)現(xiàn)其能夠抑制甘油三酯的累積和降低血脂的水平;Burri等[11]和Ferramosca 等[12]發(fā)現(xiàn),在飲食中補充磷蝦油可通過上調(diào)參與脂質(zhì)氧化的基因和下調(diào)參與脂肪生成的基因來抑制脂質(zhì)合成。

基于Label-free 的蛋白質(zhì)組學,即非標記定量蛋白質(zhì)組學技術,是通過LC-MS 對蛋白質(zhì)酶解肽段進行質(zhì)譜分析,比較不同樣品中相應肽段的信號強度,依據(jù)相同肽段的質(zhì)譜響應強度與含量成正比,從而對肽段對應的蛋白質(zhì)進行相對定量[13]。Kalayou 等[14]通過非標記定量蛋白質(zhì)組學對暴露于持續(xù)性污染物3-甲磺酰-DDE的原代新生豬睪丸間質(zhì)細胞的蛋白表達情況進行了研究,發(fā)現(xiàn)3-甲磺酰-DDE 主要作用于線粒體功能障礙、氧化磷酸化、EIF2 信號傳導和谷胱甘肽介導的解毒作用等途徑,進一步鑒定和表征這些蛋白質(zhì)有助于了解3-甲磺酰-DDE 對內(nèi)分泌系統(tǒng)干擾的分子機理;Gang等[15]通過非標記定量蛋白質(zhì)組學建立了急性白血病在兒童中患病的風險標記,發(fā)現(xiàn)高風險急性淋巴細胞白血病的發(fā)病往往與涉及前體mRNA 的剪切、DNA 損傷反應和應激反應相關蛋白的差異表達有關。

前期研究證實,灌胃南極磷蝦油后,可有效降低高脂模型小鼠血清中的總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平,并提高高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平[16]。為進一步闡明南極磷蝦油對小鼠脂代謝的調(diào)控機理,本研究采用基于Label-free 的蛋白質(zhì)組學技術分析灌胃南極磷蝦油后,高脂小鼠肝臟中脂代謝相關蛋白質(zhì)的表達變化情況,以期為后續(xù)研究南極磷蝦油對肝臟脂代謝調(diào)控機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性ICR 小鼠,體重23.33±2.17 g,購自浙江實驗動物中心公司,許可證號： SCXK(浙)2014-0001。

普通飼料由浙江省動物實驗中心提供;高脂飼料配方：豬油10%、膽固醇2.5%、膽酸鹽約1%、蔗糖20%、普通飼料66.5%。BCA 蛋白定量試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;乙腈(質(zhì)譜純),美國Fisher 公司;甲酸(色譜純),美國Sigma 公司;其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設備

Model680 型酶標儀,美國Bio-Rad 有限公司;GL20M 型高速冷凍離心機,上海盧湘離心機儀器有限公司;LC-MS 安捷倫科技有限公司;ACQUITY UPLC,美國 Waters 公司; Synapt High Definition Mass Spectrometry 高解析質(zhì)譜儀, 美國 Waters 公司;Tissuelyser-48 組織研磨儀,上海凈信實業(yè)有限公司;Scientz-25T 冷凍干燥儀,寧波新芝凍干設備股份有限公司;REDS 酶解儀,美國HST 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物分組與處理 健康ICR 小鼠隨機分為3組,每組8 只,共計24 只。適應性喂養(yǎng)一周后,正常組喂食普通飼料,灌胃生理鹽水;模型組和試驗組喂食高脂飼料進行造模,同時模型組灌胃生理鹽水,試驗組灌胃600 mg·kg-1的南極磷蝦油,連續(xù)喂養(yǎng)30 d。末次喂食后,禁食不禁水10 h,處死后,仔細剝離肝臟,稱重,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肝臟預處理和蛋白質(zhì)分離 小鼠肝臟組織剪成碎片,用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)清洗后,收集組織碎片到EP 管中,按照細胞濕重∶裂解液=1 ∶3(v/v)比例加入裂解液[4%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)+0.1% 苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)+1×磷酸酶抑制劑],然后置于組織研磨儀中,高頻(65 Hz)振蕩1 min,重復操作5 次。冰浴條件下超聲(200 W)3 min,再于4℃條件下14 000 r·min-1離心40 min,保留上清液。按照BCA 試劑盒說明書進行蛋白質(zhì)定量,12%SDS-PAGE 進行蛋白質(zhì)分離。

1.3.3 酶解及多肽純化 膠條以1 mm×1 mm 的形式放入EP 管中,水洗、脫色,還原烷基化,膠內(nèi)胰蛋白酶酶解,于酶解儀中37℃條件下反應15 h。反應結束后,立刻加入40 μL 肽段提取液(50% 乙腈+0.1% 三氟乙酸),37℃條件下反應30 min。將產(chǎn)物轉移至新的EP 管中,反復進行2 次肽段提取。反應結束后,置于冷凍干燥儀中凍干。

1.3.4 質(zhì)譜分析 質(zhì)譜條件：使用Synapt High Definition Mass Spectrometry 高解析質(zhì)譜儀,正離子檢測模式,一級分辨率為70 000,AGC 設置為1e6,噴霧電壓2 500 Ⅴ,掃描范圍350～1 600 m/z。選取10 個強度最高的離子進行MS/MS 分析,二級分辨率為17 500,AGC 設置為2e5,分離窗口為2.0 m/z;

液相條件：色譜柱為C18(250 mm×75 μm,粒徑3 μm),流動相A 為含0.1%甲酸的乙腈,流動相B 為含0.1%甲酸的水溶液,流速為300 μL·min-1,進樣體積為4 μL。具體洗脫梯度見表1。

1.3.5 數(shù)據(jù)庫搜索和生物信息學分析 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MaxQuant (1.5.6.5) 進行數(shù)據(jù)庫檢索,使用數(shù)據(jù)庫為Mouse 蛋白庫數(shù)據(jù)庫,來源于Uniprot 數(shù)據(jù)庫。將MaxQuant 搜庫結果文件中數(shù)據(jù)重新進行分析,篩選差異蛋白。將不同樣本中全部檢測到的蛋白進行非標記定量計算,將蛋白在不同樣本的蛋白強度(IBAQ)值進行兩兩比較,得到每個蛋白在任意兩組樣本中的變化倍數(shù)值(ratio)。蛋白在兩組樣本中表達量變化≥2 倍或者≤0.5 倍,則視為該蛋白在2 個條件下表達量有明顯差異。根據(jù)蛋白數(shù)據(jù)庫中的GO 注釋,分別根據(jù)分子功能(molecular function,MF)、細胞組分(cellular component,CC)、參與的生物過程(biological process,BP)進行分析,并對脂代謝相關差異蛋白通過String(10.0)進行相互作用可視化網(wǎng)路圖分析。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦油對小鼠肝臟蛋白質(zhì)表達的影響

通過Label-free 蛋白質(zhì)組學分析,共鑒定出1 943個蛋白質(zhì)。與模型組相比,正常組小鼠肝臟中共有204 個差異蛋白,其中109 個表達上調(diào),95 個表達下調(diào);喂食南極磷蝦油后的試驗組中,共鑒定出224 個差異蛋白,其中125 個表達上調(diào),99 個表達下調(diào)。而與正常組相比,試驗組共有264 個差異蛋白,其中137 個表達上調(diào),127 個表達下調(diào)。

對上述差異蛋白進行GO 分析,根據(jù)細胞組分、分子功能和生物學過程三大類進行注釋,并對GO 注釋的條目統(tǒng)計對應的差異蛋白數(shù)(圖1)。結果顯示,與模型組相比,正常組和試驗組中的差異蛋白相似,在細胞學組分中大多數(shù)與細胞質(zhì)有關,包含位于線粒體、膜、核質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等細胞質(zhì)蛋白;在分子功能中主要為結合蛋白,包括ATP 結合蛋白和金屬離子結合蛋白等;生物學過程中為具有細胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸與翻譯等功能蛋白。而與正常組相比,試驗組的差異蛋白GO分析的功能注釋與上述相似。根據(jù)此結果可從分子水平推測,南極磷蝦油的攝入有助于高脂小鼠肝臟蛋白的表達接近于正常小鼠。

圖1 差異蛋白TOP10 GO 富集分析Fig.1 TOP10 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins

2.2 脂代謝相關差異蛋白的統(tǒng)計分析

為了闡明南極磷蝦油對小鼠脂代謝的影響,進一步分析脂代謝相關蛋白的差異表達情況。本試驗共鑒定出84 個脂代謝相關蛋白。與模型組相比,正常組中有8 個表達上調(diào),占比9.52%,12 個表達下調(diào),占比14.28%,64 個表達無差異,占比76.19%(圖2-A);與模型組相比,試驗組中有14 個蛋白質(zhì)表達上調(diào),占比16.67%,表達下調(diào)的有8 個,占比9.52%,62 個蛋白質(zhì)表達無差異,占比73.81%(圖2-B);試驗組與正常組相比,有17 個表達上調(diào)的蛋白質(zhì),占比20.24%,6個表達下調(diào),占比7.14%,有61 個表達無差異,占比72.62%(圖2-C)。上述差異表達蛋白,包括了與脂質(zhì)合成代謝、脂質(zhì)分解代謝、膽固醇轉化及磷酯代謝等相關的蛋白質(zhì)(表2)。

此外,與模型組相比,有7 個脂代謝相關差異蛋白在正常組和試驗組中均被鑒定出,且具有一致的表達趨勢。上述差異蛋白包括上調(diào)表達的棕櫚酰蛋白硫酯酶1 (palmitoyl-protein thioesterase 1, PPT1)、載脂蛋白B100(apolipoprotein B-100,APOB100)、短支鏈酰基輔酶A 脫氫酶(acyl-CoA dehydrogenase,short/branched chain,ACADSB)、3 - 羥基酰基-CoA 脫水酶3 (3-hydroxyacyl-CoA dehydratase 3,HACD3)和磺基轉移酶1A1(sulfotransferase 1A1,SULT1A1);下調(diào)表達的酰基輔酶 A 合成酶家族成員3 (acyl-CoA synthetase medium-chain family member 3,ACSM3)、酰基輔酶A合成酶家族成員2(acyl-CoA synthetase family member 2, mitochondrial, ACSF2)。

上述差異蛋白質(zhì)參與的主要信號轉導通路包括固醇類激素的生物合成、脂肪酸代謝、PPAR 信號途徑、亞油酸代謝、脂肪酸的生物合成和脂肪酸延伸。由表3 可知,ACADSB 在正常組和試驗組中均表達上調(diào)。與此相反,涉及脂肪酸合成的兩類重要的蛋白酶,脂肪酸去飽和酶2(fatty acid desaturase 2, FADS2)和長鏈脂肪酸延長酶2(elongation of very long chain fatty acidprotein 2, ELOV2)在試驗組中表達下調(diào),但這兩類酶在正常組中并沒有差異表達。由此推測,FADS2 和ELOV2 在南極磷蝦油抑制脂質(zhì)合成的途徑中發(fā)揮著重要作用。

表2 脂代謝相關蛋白Table 2 Lipid metabolism related proteins

圖2 脂代謝蛋白的差異表達情況Fig.2 Differential expression of lipid metabolism proteins

此外,細胞色素P450 家族的蛋白質(zhì),包括細胞色素P450 2D11(cytochrome P450 2D11、CYP2D11)、細胞色素P450 2C29(cytochrome P450 2C29、CYP2C29)、細胞色素 P450 2C39 ( cytochrome P450 2C39、CYP2C39)、細胞色素P450 2B9 (cytochrome P450 2B9、CYP2B9) 和細胞色素P450 3A13(cytochrome P450 3A13、CYP3A13),在各組中均有不同程度的差異表達。細胞色素P450 家族成員是一類血紅素硫醇鹽單加氧酶,該酶參與NADPH 依賴性電子傳遞途徑,在類固醇、脂肪酸的分解或合成代謝途徑,以及能量代謝中具有重要作用[17-18]。由此可見,南極磷蝦油的攝入對于小鼠機體中的能量代謝也產(chǎn)生了較大的影響。

表3 脂代謝KEGG 通路Table 3 Lipid metabolism KEGG pathway

2.3 脂代謝差異蛋白的相互作用分析

蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用圖(protein-protein interactions,PPI)有助于了解差異蛋白的細胞功能和作用機制[19]。為了進一步說明上述差異蛋白在調(diào)節(jié)脂代謝中的作用方式,STRING(10.5)被用來檢測差異蛋白的功能關系,并生成PPI 網(wǎng)絡圖(圖3)。每個球體代表一種蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)的空間距離越近,代表它們的功能越接近。同時,蛋白質(zhì)連接在一條直線段上,線段越多,蛋白質(zhì)之間的相互作用越緊密。條紋之間的藍線表示蛋白質(zhì)之間的功能關聯(lián),線條的厚度代表所報告的相關信度水平[20]。

正常組中,除脂肪酸酰胺水解酶(fatty-acid amide hydrolase,FAAH)外,其他蛋白質(zhì)在脂肪酸代謝過程中均有密切的相互作用(圖3-A);試驗組中,ACSM3 參與了酰基輔酶A 的代謝和脂肪酸β 氧化,說明脂代謝與糖代謝之間存在一定的密切聯(lián)系(圖3-B);在試驗組和正常組中,ACADSB、ACSM3 和ACSF2 均參與了脂肪酸代謝,并與其他蛋白具有密切的聯(lián)系。此外,與正常組相比,試驗組中除ELOVI2 外,其他蛋白質(zhì)在脂肪酸代謝過程中均有密切的相互作用。上述結果表明, ACADSB、ACSM3 及ACSF2 這些蛋白質(zhì)可能是南極磷蝦油調(diào)節(jié)脂代謝的重要調(diào)控蛋白。南極磷蝦油的攝入可能通過改變這些蛋白質(zhì)的表達,進而改變下游的代謝途徑,達到降低血脂、減輕體重的作用。

圖3 脂代謝差異表達蛋白的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析Fig.3 The visualization network diagram of DEGs involved in lipid metabolism

3 討論

機體內(nèi)的過量脂肪以三酰基甘油的方式進行存儲,并可能導致肥胖等一系列的疾病。以EPA、DHA為主的不飽和脂肪酸則可以通過調(diào)節(jié)脂肪代謝,起到預防肥胖和脂代謝相關疾病的作用。前期研究證實,喂食南極磷蝦油對高脂小鼠的體重起到了一定的抑制作用,表明南極磷蝦油對高脂小鼠有一定的降血脂作用,緩解了高脂誘導的脂代謝紊亂現(xiàn)象,這與目前已有的研究一致[16]。

本研究利用Label-free 蛋白質(zhì)組學技術,對灌胃南極磷蝦油后高脂小鼠肝臟蛋白的差異表達情況進行分析,并對脂代謝相關差異蛋白的表達模式進行了比較。結果表明,與模型組相比, ACADSB 在試驗組和正常組中均表達上調(diào),而ACSF2 和ACSM3 均下調(diào)。研究表明,ACADSB 基因缺失會造成異亮氨酸的代謝紊亂,在組織中產(chǎn)生2-methylbutyryglycine (2MBG) 和2-methylbutyric acid(2MB)的積累,2MBG 能促進硫代巴比妥酸的反應活性組分,導致脂質(zhì)氧化增加[21]。ACADSB 的上調(diào)表達,可能意味著南極磷蝦油的攝入,能夠促進脂肪酸的β 氧化,減少脂質(zhì)積累;而ACSF2和ACSM3 均為酰基輔酶A 合成酶家族中的一員,分別參與不同鏈長脂肪酸的合成[22-24],其表達下調(diào)意味著南極磷蝦油可能具有抑制脂肪酸合成的作用。

本研究中,一些重要的參與脂質(zhì)代謝的蛋白質(zhì)在試驗組中呈上調(diào)表達,但在正常組中表達不變或下調(diào),包括HSD17B8、HSD17B6 和LPCAT。HSD17B8 和HSD17B6 是 17β - 羥基類固醇脫氫酶(17βhydroxysteroid dehydrogenase,17β-HSDs)家族成員,參與了脂肪酸和膽固醇的代謝,對維持哺乳動物體內(nèi)激素之間的平衡、調(diào)節(jié)激素生成和代謝發(fā)揮著重要的作用[25-26]。該類酶的表達及活性與性激素和脂代謝紊亂相關疾病的發(fā)病緊密相關。HSD17B8 可有效催化雌二醇、睪酮、雙氫睪酮的氧化,并可在一定程度上催化雌酮還原為雌二醇[27-28],且這兩類蛋白質(zhì)均參與了類固醇的代謝過程[29]。LPCAT 在將磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)sn-2 位上的△6 去飽和酶和其他去飽和酶作用的中間產(chǎn)物(如GLA)轉移至酰基CoA 庫的過程中起著至關重要的作用[30-32],該蛋白能夠調(diào)節(jié)血漿脂蛋白顆粒,對身體有良好的促進和改善作用。本研究中,試驗組中LPCAT 的上調(diào)表達表明,該蛋白對南極磷蝦油維持小鼠體內(nèi)的脂蛋白含量平衡具有重要作用。由此可見,南極磷蝦油對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié),不僅影響體重、血脂等指標,也可能涉及到糖代謝調(diào)節(jié)和激素合成調(diào)節(jié)。

富含磷酯型多不飽和脂肪酸的磷蝦油一直以來備受人們關注,其對提高學習記憶能力[33-34],提高免疫力[35-36],以及對肝臟功能的調(diào)節(jié)作用[37]已被廣泛論證。而磷蝦油的作用機理也被不斷地研究, 如Ferramosca 等[12]分析了肝臟線粒體中與脂肪酸合成和脂肪氧化相關的蛋白酶活性,認為磷蝦油通過維持肝臟的氧化磷酸化,起到了減輕體重的作用。Burri等[11]根據(jù)肝臟轉錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),磷蝦油的補充使脂質(zhì)和膽固醇合成途徑中的相關基因表達下調(diào)。而本研究利用蛋白質(zhì)組學技術,進一步深入研究了磷蝦油對降低血脂和減輕體重的作用途徑,為揭示磷蝦油對肝臟功能的調(diào)節(jié)作用提供了數(shù)據(jù)。

4 結論

本研究以高脂模型小鼠的肝臟為對象,利用非標記蛋白質(zhì)定量、功能性蛋白質(zhì)網(wǎng)絡分析等技術手段研究了南極磷蝦油對高脂小鼠肝臟脂代謝的調(diào)控機制。根究研究推測,參與脂肪酸β 氧化的ACADSB 及參與脂肪酸合成代謝的ACSM3 和ACSF2 是南極磷蝦油調(diào)節(jié)脂代謝的重要調(diào)控蛋白質(zhì)。同時,FADS2 和ELOV2在南極磷蝦油抑制脂質(zhì)合成途徑中也發(fā)揮著重要作用。本研究結果在蛋白質(zhì)組學層面上解釋了南極磷蝦油降血脂的作用機理,同時證實ACADSM、ACSM3、ACSF2、FADS2 和ELOV2 等蛋白質(zhì)在脂代謝調(diào)控中具有重要作用。但它們的具體作用方式仍有待進一步探究。