干旱脅迫下野生大豆ABC轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)錄組測序分析

張小芳 喬亞科 王冰冰 徐 燕 張 鍇 李桂蘭

(河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院,河北秦皇島 066600)

野生大豆(Glycine soja)是栽培大豆的近緣野生種[1]。研究表明,野生大豆中攜帶著特有的新基因[2],而栽培大豆在人工馴化過程丟失了許多與環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的重要基因,包括一些與抗逆相關(guān)的基因[3]。因此對野生大豆抗逆基因的挖掘具有重要意義。

三磷酸腺苷結(jié)合盒(ATP-binding cassette, ABC)跨膜轉(zhuǎn)運蛋白是植物細(xì)胞膜蛋白的重要組成成分,參與植物激素運輸、氣孔調(diào)節(jié)、次生代謝物的運輸以及響應(yīng)環(huán)境脅迫等過程[4]。最初人們對ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族的研究多集中于多藥耐藥性研究[5-6],隨著對ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),植物中任何特定的生理過程都至少需要1 個ABC 轉(zhuǎn)運蛋白[7],因此對植物ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的研究具有重要意義。

近年來,已有關(guān)于植物ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運機(jī)制的研究報道[8-10],除對擬南芥[11]、水稻[12]的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族進(jìn)行整體研究外,在鐵皮石斛[13]、葡萄[14]和黃瓜[15]等中也開展了部分基因的研究,鑒定的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白主要在ABCB、ABCC 和ABCG 家族[16-19]中。目前大豆的基因組已經(jīng)完成測序,但關(guān)于豆科ABC 轉(zhuǎn)運蛋白各家族相關(guān)基因的研究尚鮮見報道[20-21]。

隨著高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展,利用生物信息學(xué)對轉(zhuǎn)錄組測序的深入挖掘已成為研究重點[22-25],目前,已有多種具有特定功能的大豆或野生大豆基因被挖掘與利用[26-29]。本研究以抗旱性較強的野生大豆永46 為試驗材料,對其轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行功能注釋后,以ABC 轉(zhuǎn)運蛋白為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選,對獲得的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白進(jìn)行多角度分析,探討ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族與干旱之間的關(guān)系,以期為ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族基因的挖掘和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以河北科技師范學(xué)院野生大豆種質(zhì)資源課題組篩選鑒定的抗旱性強的野生大豆永46 為試驗材料[30],采自河北省秦皇島市昌黎縣,并在河北科技師范學(xué)院植物細(xì)胞工程實驗室保存。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

將野生大豆永46 的種子播種于營養(yǎng)缽中,出苗后保留長勢一致的幼苗10 株,設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。定期澆定量霍格蘭營養(yǎng)液,在苗齡達(dá)30 d 時,加入20%PEG 6000 進(jìn)行干旱脅迫處理,分別在處理前(0 h)及處理后6、12、24 和48 h 取同一個葉位的復(fù)葉,按照RNA 提取試劑盒[TaKaRa(日本)]提供的方法提取野生大豆葉片總RNA。取2 μL 所得RNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測合格后送至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測序,具體步驟參考張小芳等[31]的方法。

1.3 功能注釋及ABC 轉(zhuǎn)運蛋白關(guān)鍵詞搜索

BLAST 比對到公共數(shù)據(jù)庫,包括非冗余數(shù)據(jù)庫(non-redundant, NR)、基因本體論數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG),之后以ABC 轉(zhuǎn)運蛋白為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選,最終獲得ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族相關(guān)信息。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)獲得的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族信息,利用Excel 2007、ClustalX 和MEGA5.1 分析獲得的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白基因簇的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因簇信息分析

對轉(zhuǎn)錄組中39 183 條基因簇以ABC 轉(zhuǎn)運蛋白為關(guān)鍵詞在NR、GO、KEGG 3 個數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行篩選,結(jié)果共有337 條基因簇被注釋,這些基因簇的表達(dá)量FPKM 值介于0～180.57 之間,序列拼接長度介于165～6 827 bp 之間。這些被注釋的基因簇中,87.83%在3 個數(shù)據(jù)庫中均有注釋,3.86%只注釋到了1 個數(shù)據(jù)庫中。有299 條被GO 數(shù)據(jù)庫注釋、321 條被KEGG 數(shù)據(jù)庫注釋、146 條被NR 數(shù)據(jù)庫注釋。GO 本體中注釋的細(xì)胞組分?jǐn)?shù)據(jù)庫有13 個,分子功能數(shù)據(jù)庫有34 個,生物過程數(shù)據(jù)庫有68 個;NR 數(shù)據(jù)庫中注釋的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族有8 個,包括ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、ABCG 和ABCI(表1)。KEGG 注釋的有28 個代謝途徑分支,排名前10 的為K05658(226 個)、K00924(102 個)、K12843(81 個)、K05681(80 個)、K04733(54 個)、K05666(40 個)、K02065(20 個)、K13430(15 個)、K05643(13 個)、K05663(13 個)。

表1 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族相關(guān)基因簇統(tǒng)計Table 1 Statistical of Unigene about ABC transporter family

2.2 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)差異表達(dá)基因分析

對獲取的原始基因簇信息進(jìn)行差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)篩選,篩選閾值為P-value ≤0.05, | log2Fold Changes | ＞1,其中Fold Changes 為處理材料與未處理材料中基因表達(dá)量的比值,對于差異表達(dá)基因,其log2Fold Change＞0 時,則認(rèn)為該差異表達(dá)基因是上調(diào)的, 反之, 若log2Fold Changes＜0,則認(rèn)為該差異表達(dá)基因是下調(diào)的。篩選獲得的DEGs 共182 個。干旱脅迫處理12 h 時涉及到的差異表達(dá)基因最豐富。在干旱脅迫處理12 h 時,差異表達(dá)基因為118 個,其中上調(diào)基因93 個,下調(diào)基因25個。干旱脅迫處理24 h 時,差異表達(dá)基因涉及范圍變小,與未經(jīng)干旱脅迫(0 h)相比,僅有36 個表現(xiàn)為差異表達(dá),與干旱脅迫處理12 h 相比,上調(diào)基因減少,下調(diào)基因增多,說明部分基因在干旱脅迫處理24 h 時表達(dá)量上調(diào),之后恢復(fù)原始表達(dá)量或低于原始表達(dá)量。干旱脅迫處理48 h 時,其變化趨勢與干旱脅迫處理24 h相同,涉及的差異表達(dá)基因數(shù)無明顯變化,較干旱脅迫處理24 h 表現(xiàn)為差異表達(dá)的基因僅有14 個(圖1)。

圖1 不同脅迫處理時期的差異表達(dá)基因統(tǒng)計分析Fig.1 Statistical analysis of DGEs under different stress treatment periods

2.3 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)差異表達(dá)基因功能分析

2.3.1 GO 功能顯著性富集分析 GO 共有3 個本體(ontology), 分別描述基因的細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物過程(biological process)。在被注釋的13 個細(xì)胞組分?jǐn)?shù)據(jù)庫、34 個分子功能數(shù)據(jù)庫和68 個生物過程數(shù)據(jù)庫中分別有11 個、28 個和50 個數(shù)據(jù)庫注釋到差異表達(dá)基因。由圖2 可知,多數(shù)基因有分子功能和生物學(xué)過程注釋。分子功能主要為 ATP 酶活性(ATPase activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、轉(zhuǎn)運活性(transferase activity)、氧化活性(oxidoreductase activity)等;生物學(xué)過程主要為嘌呤核苷酸分解過程(purine ribonucleotide catabolic process)、磷酸化合物代謝過程( phosphate-containing compound metabolic process)、蛋白質(zhì)修飾(cellular protein modification process)、囊泡運輸(vesicle-mediated transport)、羧酸轉(zhuǎn)運(carboxylic acid transmembrane transporter activity)、激素應(yīng)答(response to hormone stimulus)等。

圖2 3 個GO 本體中數(shù)量排名前10 的GO 分類統(tǒng)計情況Fig.2 The number of top 10 in 3 gene ontology classification

由表2 可知,6 個細(xì)胞組分?jǐn)?shù)據(jù)庫、4 個分子功能數(shù)據(jù)庫和17 個生物過程數(shù)據(jù)庫中注釋的基因均表現(xiàn)為差異表達(dá),在細(xì)胞組分本體中,主要定位在細(xì)胞膜系統(tǒng)中,與ABC 轉(zhuǎn)運蛋白作用場所相符;在分子功能本體中,功能分類為轉(zhuǎn)運活性或轉(zhuǎn)移酶活性,與其作用功能相一致;在生物學(xué)過程本體中,注釋的生物學(xué)過程多樣,充分體現(xiàn)了ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的功能多樣性。

2.3.2 KEGG 功能顯著性富集分析 在KEGG 數(shù)據(jù)庫中注釋的28 個途徑分支中,有9 個途徑分支被注釋到了ABC 轉(zhuǎn)運蛋白途徑(map02010)。這9 個途徑分支分別是 K05641 ( ABCA1)、K05643(ABCA3)、K05658 ( ABCB1)、K05663 ( ATM)、K05656 ( ABCB9)、K05657 ( ABCB10)、K05666(ABCC2)、K05677(ABCD3)、K05681(ABCG2), 共包括ABCA、ABCB、ABCC、ABCD 和ABCG 5 個亞家族。K05658 途徑在各個時期均出現(xiàn)差異表達(dá)基因,K05681 途徑在各個時期均有上調(diào)基因分布,K05666 途徑在各個時期均有下調(diào)基因分布,K05663 途徑僅在干旱脅迫處理48 h/6 h 有下調(diào)基因分布,且下調(diào)基因僅有1 個。在各時期中,干旱脅迫處理6 h 和12 h 的差異表達(dá)基因最多,之后基因表達(dá)量變化范圍變小,直至恢復(fù)到原始水平(表3)。

2.3.3 NR 功能聚類分析 對符合篩選條件的182 個差異表達(dá)基因在NR 數(shù)據(jù)庫注釋功能,獲得差異表達(dá)基因的蛋白信息(有14 個沒有注釋,共統(tǒng)計168 個)。用鄰接法對差異表達(dá)基因的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析。分析結(jié)果表明,可將這168 個差異表達(dá)基因分為三大類25 小類。第一大類有3 小類,包括43 個差異表達(dá)基因,第二大類有6 小類,包括43 個差異表達(dá)基因,第三大類有16 小類,包括82 個差異表達(dá)基因。第一大類主要是ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族的ABCE(1 個)、ABCF(5 個)、ABCG 家族(23 個)以及多藥耐藥蛋白(pleiotropic drug resistance protein);第二大類主要是ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族的ABCB(21 個)與ABCC(17 個)家族;第三大類涉及基因最為廣泛,除ABCA 家族(4個)、ABCD 家族(2 個)外,還包括鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白(zinc finger CCCH domain-containing protein)、U-box 結(jié)構(gòu)域蛋白(U-box domain-containing protein)、L 型外源凝集素受體蛋白(L-type lectin-domain containing receptor kinase)、富亮氨酸重復(fù)受體蛋白(leucine-rich repeat receptor-like serine/threonine-protein kinase)以及其他不同的蛋白激酶家族成員等。在進(jìn)化分析時,NR注釋功能為ABCI 家族的蛋白序列共有3 個(ABCI10、ABCI11、ABCI19),這3 個序列分別聚類在了第二大類、第一大類和第三大類中(圖3)。

表2 不同GO 下的差異表達(dá)基因注釋統(tǒng)計Table 2 Statistical of DEGs in different GO

對注釋功能為ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族的基因進(jìn)行統(tǒng)計分析。除ABCC 家族外,各家族中涉及的差異表達(dá)基因多為上調(diào)基因;ABCA 家族共涉及4 個基因,3 個為上調(diào)基因,1 個為下調(diào)基因;ABCB 家族共涉及21 個基因,其中g(shù)lysoja_016804 表達(dá)量差異倍數(shù)達(dá)-10.75,glysoja_ 023579 表達(dá)量差異倍數(shù)達(dá)10.54, 為注釋到的基因中表達(dá)量變化最大的2 個基因;ABCC 家族共涉及17 個基因,表達(dá)量變化明顯,最高差異表達(dá)倍數(shù)為9.32;ABCD 家族共涉及2 個基因,表達(dá)量變化幅度較小;ABCE 家族僅涉及1 個基因,且該基因為上調(diào)基因;ABCF 家族共涉及5 個基因,均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá);ABCG 家族共涉及23 個基因,上調(diào)表達(dá)較多;ABCI家族共涉及3 個基因(表4)。

表3 差異表達(dá)基因的KEGG 通路富集分析Table 3 Statistical of DEGs in different pathway

表4 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族的差異表達(dá)基因分析Table 4 Statistical of DEGs in ABC transporter family

圖3 差異表達(dá)基因的親緣關(guān)系分析Fig.3 Genetic relationship analysis of DEGs

2.4 基因表達(dá)量分析

對同時注釋到GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫,且注釋基因均差異表達(dá)的基因在干旱脅迫處理12 h 前的表達(dá)量變化進(jìn)行匯總分析。由表5 可知,不同基因的原始表達(dá)量存在差異,glysoja_008864 和glysoja_010956 在干旱脅迫處理0 h 的FPKM 值均在100 以上,而glysoja_017978 和glysoja_047568 在干旱脅迫處理0 h 的FPKM 值均為0;多數(shù)基因在干旱脅迫處理12 h 表達(dá)量變化最明顯,glysoja_005213 和glysoja_010956 則在6 h 的表達(dá)量變化最明顯,而glysoja_008864、glysoja_010547 和glysoja_024284 在干旱脅迫處理12 h 前的表達(dá)量變化無明顯差異;glysoja_010547 和glysoja_013434 的注釋均為APK1A,其原始表達(dá)量差距不大,glysoja_002097 和glysoja_010956 的注釋均為ABCC 家族,但原始表達(dá)量差異較大。

3 討論

本研究系統(tǒng)分析了野生大豆8 類ABC 轉(zhuǎn)運蛋白基因?qū)Ω珊得{迫的響應(yīng),結(jié)果表明,不同處理時期對應(yīng)基因種類和數(shù)目不同,同一基因在不同處理時期表達(dá)量也不同。在氨基酸進(jìn)化分析時,聚類結(jié)果并未被分為8 類,說明在進(jìn)化上有一定的保守性,但功能發(fā)生了改變,說明其結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化,對基因產(chǎn)物的功能產(chǎn)生了一定的影響。通過對野生大豆干旱脅迫下的ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族基因的系統(tǒng)研究,為挖掘具有抗旱功能的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的研究提供了新思路。

本研究在GO 生物學(xué)過程聚類分析中,部分GO條目未被注釋到,差異表達(dá)基因在5 個以上的GO 條目增加了GO：0009154(嘌呤核苷酸分解代謝過程)、GO：0006796 (含磷酸鹽化合物代謝過程)、GO：0006464(細(xì)胞蛋白質(zhì)變性過程)、GO：0006468(蛋白質(zhì)磷酸化)、GO：0006952(防御反應(yīng))和GO：0010038(金屬離子響應(yīng));在KEGG 途徑中,ABCA、ABCB、ABCC、ABCD 和ABCG 家族成員注釋為差異表達(dá),表明這5個亞家族與干旱相關(guān),注釋的GO 本體與朱璐等[32]注釋結(jié)果略有不同。

表5 差異表達(dá)基因表達(dá)量分析Table 5 Analysis on the expression of DEGs

Byrne 等[33]發(fā)現(xiàn)黑麥草在亞硒酸鈉的誘導(dǎo)下ABCA 家族的基因表達(dá)量顯著增加,Maathuis 等[34]發(fā)現(xiàn)AtATH14 與AtATH15 在鹽脅迫下表達(dá)下調(diào);Wu等[35]發(fā)現(xiàn)AtABCB19 可以使種子萌發(fā)后下胚軸快速的伸長。Lee 等[36]發(fā)現(xiàn)AtABCB14 可通過將蘋果酸鹽從質(zhì)外體運輸?shù)奖Ｐl(wèi)細(xì)胞, 提高滲透壓來調(diào)控氣孔對CO2的響應(yīng), 從而調(diào)控氣孔的開合;AtABC5 也可以通過調(diào)節(jié)氣孔開閉來增強植物的抗逆性[37];擬南芥中AtABCG40、AtPDR12 基因的表達(dá)能夠提高植物的抗旱能力[2];水稻OsABCG36 基因也參與了植物的抗旱反應(yīng)[38];大豆GmPDR12 基因在水楊酸及功能類似物質(zhì)的誘導(dǎo)下能夠快速大量表達(dá)[7]。本研究中,注釋到的ABCA 家族基因既有上調(diào)也有下調(diào),注釋基因有ABCA1、ABCA2 和ABCA7;ABCA1 主要參與膽固醇的逆轉(zhuǎn)運過程[39],AtABCA2(別名AtATH1)與擬南芥的開花相關(guān)[40],ABCA7 與人體的阿爾茨海默病相關(guān)[41],但在植物中的功能尚不清楚;注釋到的ABCB 家族基因上調(diào)和下調(diào)明顯,注釋基因有ABCB1、ABCB4、ABCB6、ABCB11、ABCB13、ABCB25、ABCB26 等,與徐杏等[42]的研究結(jié)果一致;注釋到的ABCC 家族除已知的與干旱脅迫相關(guān)的ABCC5 外, 還包括ABCC8、ABCC10、ABCC13 和ABCC14 等,AtABCC10 證實與病原反應(yīng)相關(guān)[13], AtABCC13 與營養(yǎng)生長相關(guān)[32];注釋到的ABCG 家族包含的基因種類最多,關(guān)于ABCG11、ABCG14、ABCG22、ABCG32、ABCG36 基因功能已有研究報道[11,43],本研究中還注釋到了ABCG3、ABCG7、ABCG15、ABCG21、ABCG41(PDR13)等,AtABCG3 參與PC-Cd 的運輸[44];VvABCG7 與葡萄的胚珠發(fā)育有關(guān)[11],注釋到的ABCD 家族僅包含2 個基因(ABCD1和ABCD2),研究表明ABCD1 可能對植物與病原菌、有害動植物以及共生體間相互作用有關(guān)鍵作用[45],ABCD2 的功能仍未知,尚需要進(jìn)一步的研究證明。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,野生大豆ABC 轉(zhuǎn)運蛋白基因在干旱脅迫12 h 差異表達(dá)數(shù)量最多,且在24 h 和48 h無明顯差異。ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的不同家族基因?qū)Ω珊得{迫的響應(yīng)存在差異,ABCB、ABCC 和ABCG 家族的響應(yīng)基因最多,ABCE 家族的響應(yīng)基因最少。出現(xiàn)差異表達(dá)的基因也是ABCB、ABCC 和ABCG 家族最多,ABCE 家族最少。在GO 生物學(xué)過程中,嘌呤核苷酸分解代謝過程的注釋基因最多。在注釋到KEGG 途徑的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白途徑中,K05658(ABCB1),K05681(ABCG)和K05666(ABCC)的注釋基因最多,K05663(ATM)最少。本研究結(jié)果為抗旱基因的挖掘提供了新的基因資源。