乳腺癌組織及外周血纖維連接蛋白EDA片段基因拷貝數(shù)變異對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響研究

郝曉妍 彭勛 任光輝

【摘要】 目的 研究對(duì)比乳腺癌組織及外周血纖維連接蛋白（FN）蛋白結(jié)構(gòu)域A（EDA）片段基因拷貝數(shù)變異對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響。方法 100例手術(shù)切除的乳腺癌改良根治術(shù)標(biāo)本， 其中出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例作為轉(zhuǎn)移組， 無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例作為無(wú)轉(zhuǎn)移組;另選取同期進(jìn)行乳腺癌根治術(shù)切除標(biāo)本癌旁乳腺組織（正常組織）50例作為對(duì)照組。對(duì)三組血纖維連接蛋白EDA片段基因進(jìn)行分析， 觀察并對(duì)比三組標(biāo)本細(xì)胞株中FN基因EDA蛋白的表達(dá)及EDA片段FN mRNA相對(duì)表達(dá)量情況。結(jié)果 轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性細(xì)胞率（93.3±2.4）%高于無(wú)轉(zhuǎn)移組的（71.9±4.8）%和對(duì)照組的（5.4±1.1）%， 且無(wú)轉(zhuǎn)移組高于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)移組mRNA相對(duì)表達(dá)量（2.75±0.70）高于無(wú)轉(zhuǎn)移組的（1.74±0.44）和對(duì)照組的（1.00±0.02）， 且無(wú)轉(zhuǎn)移組高于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 FN基因EDA片段在乳腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到了重要的作用， 其與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌;外周血纖維連接蛋白;乳腺癌轉(zhuǎn)移;蛋白結(jié)構(gòu)域A片段

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.19.107

纖維連接蛋白是一種單基因編碼組成的多功能糖蛋白， 其主要分布于體液及血漿中， 在細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞膜中也有少量分布[1]。有研究表明[2]， 其在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲的過(guò)程中起到了非常重要的作用。隨著研究的不斷深入， 近年來(lái)醫(yī)學(xué)界發(fā)現(xiàn)含有EDA片段的FN在腫瘤組織中呈現(xiàn)異常的高表達(dá)情況， 因此對(duì)于FN基因EDA的片段已經(jīng)變成現(xiàn)如今腫瘤醫(yī)學(xué)熱議的問(wèn)題[3]。本研究旨在探究對(duì)比乳腺癌組織及外周血FN EDA片段基因拷貝數(shù)變異對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2014年1月～2017年1月手術(shù)切除的乳腺癌改良根治術(shù)標(biāo)本100例， 其中出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例作為轉(zhuǎn)移組， 無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例作為無(wú)轉(zhuǎn)移組;另選取同期進(jìn)行乳腺癌根治術(shù)切除標(biāo)本癌旁乳腺組織（正常組織）50例作為對(duì)照組。

1. 2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 2. 1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①患者的預(yù)期生存期≥3個(gè)月;②無(wú)精神疾病， 有良好的治療依從性;③患者經(jīng)組織學(xué)確診， 且符合國(guó)際抗癌聯(lián)盟對(duì)于乳腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)。

1. 2. 2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①存在腦部轉(zhuǎn)移的患者;②妊娠、哺乳等特殊生理時(shí)期的患者。

1. 3 方法

1. 3. 1 標(biāo)本采集 采集研究對(duì)象組織標(biāo)本以及患者外周血3 ml。

1. 3. 2 脫氧核糖核酸（DNA）提取 采用美國(guó)Qiagen基因組DNA提取試劑盒， 嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行DNA的提取。

1. 3. 3 DNA鑒定、定量 提取DNA樣品后， 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 預(yù)估濃度和DNA降解程度。對(duì)于濃度過(guò)低或者講解程度過(guò)高的樣本， 重新提取DNA。用微量紫外分光光度計(jì)對(duì)所有DNA樣本進(jìn)行濃度測(cè)定， 并標(biāo)記至10 ng/μl， 備用。

1. 3. 4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增 采用AeeuCopyTM多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取2 μl DNA模板與2 μl內(nèi)對(duì)照DNA混合液混勻后， 加入10 μl 2×PCR Master Mix， 1 μl多重PCR引物混合液以及5 μl雙蒸水（ddH2O）。

1. 3. 5 纖維連接蛋白EDA片段基因拷貝數(shù)變異檢測(cè) 取1 μl PCR產(chǎn)物稀釋20倍后， 取1 μl與0.5 μl Liz500 SIZE STANDARD， 8.5 μl HI-DI混勻， 95℃變形5 min后上AABI 3130XL DNA測(cè)序儀。根據(jù)每個(gè)基因的樣本DNA/內(nèi)對(duì)照DNA擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度及熒光標(biāo)記信息， 利用GeneMapper 4.0對(duì)ABI3130XL測(cè)序儀生成的數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析， 輸出每個(gè)產(chǎn)物峰的峰高以及峰面積。輸出結(jié)果采用Excel進(jìn)行整理、統(tǒng)計(jì)和分析。

1. 4 觀察指標(biāo) 觀察并對(duì)比三組標(biāo)本細(xì)胞株中FN基因EDA蛋白的表達(dá)及EDA片段FN mRNA相對(duì)表達(dá)量情況。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性細(xì)胞率（93.3±2.4）%高于無(wú)轉(zhuǎn)移組的（71.9±4.8）%和對(duì)照組的（5.4±1.1）%， 且無(wú)轉(zhuǎn)移組高于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)移組mRNA相對(duì)表達(dá)量（2.75±0.70）高于無(wú)轉(zhuǎn)移組的（1.74±0.44）和對(duì)照組的（1.00±0.02）， 且無(wú)轉(zhuǎn)移組高于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一， 占女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位， 其不只是局部腫瘤， 也是一種全身性疾病， 其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。血行轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要途徑， 通過(guò)血液循環(huán)的作用， 腫瘤細(xì)胞很容易轉(zhuǎn)移到全身到達(dá)其他組織和器官。纖維粘連蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分之一， 其廣泛分布于血漿以及細(xì)胞外基質(zhì)中?，F(xiàn)代研究表明， 大多數(shù)正常組織細(xì)胞外基質(zhì)中并不存在EDA-FN的表達(dá)， 且良性腫瘤中EDA-FN的表達(dá)也不明顯。但通過(guò)增生旺盛的組織研究發(fā)現(xiàn)， 這類(lèi)組織中EDA片段呈現(xiàn)異常高表達(dá)， 陽(yáng)性表達(dá)的EDA-FN及其mRNA在惡性腫瘤周?chē)磻?yīng)區(qū)的間質(zhì)中和腫瘤細(xì)胞內(nèi)普遍呈現(xiàn)高表達(dá)， 說(shuō)明該片段與細(xì)胞的遷移和增殖關(guān)系密切[4-6]。

國(guó)內(nèi)外目前普遍認(rèn)為， 惡性腫瘤中EDA-FN以及其mRNA存在明顯的高表達(dá)， 但在良性腫瘤中并不明顯， 且某些惡性腫瘤中的EDA-FN的表達(dá)程度與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力以及預(yù)后情況存在明顯的相關(guān)性[7]。相關(guān)研究結(jié)果顯示， 乳腺癌患者癌細(xì)胞核基質(zhì)中的EDA+FN表達(dá)率分別為45%和69%。本研究結(jié)果顯示， 乳腺癌無(wú)轉(zhuǎn)移的患者表達(dá)率為（71.9±4.8）%， 大致與同類(lèi)研究相符。此外， 在正常的乳腺組織中極少表達(dá)EDA-FN， 與之相反， 在分化不良或者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中EDA-FN的表達(dá)率更高。廣義而言， 細(xì)胞的遷移是指細(xì)胞從其原本的位置遷移到另外一個(gè)位置， 而轉(zhuǎn)移則指的是癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶， 移動(dòng)到其他的組織或器官， 并在所到處增殖形成另外一個(gè)腫瘤的過(guò)程。EDA能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附以及轉(zhuǎn)移， EDA-FN在淋巴管形成與發(fā)育中也起到了至關(guān)重要的作用， 且在胚胎的發(fā)生期間， EDA可以促進(jìn)淋巴管生成中一些關(guān)鍵的因子比如轉(zhuǎn)錄因子Proxl、纖維狀激動(dòng)蛋白等， 從而促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的出芽、遷移[8]。

本研究結(jié)果顯示， 轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性細(xì)胞率（93.3±2.4）%高于無(wú)轉(zhuǎn)移組的（71.9±4.8）%和對(duì)照組的（5.4±1.1）%， 且無(wú)轉(zhuǎn)移組高于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著轉(zhuǎn)移程度的逐漸加深， FN基因中EDA蛋白表達(dá)情況也越來(lái)越高。轉(zhuǎn)移組mRNA相對(duì)表達(dá)量（2.75±0.70）高于無(wú)轉(zhuǎn)移組的（1.74±0.44）和對(duì)照組的（1.00±0.02）， 且無(wú)轉(zhuǎn)移組高于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。三組標(biāo)本EDA片段FN mRNA的表達(dá)量均有差異， 且隨著轉(zhuǎn)移程度的加深， 表達(dá)量也明顯增加。

綜上所述， FN基因EDA片段在乳腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到了重要的作用， 其與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)， 對(duì)于EDA的深入研究有望打開(kāi)治療腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的新篇章。

參考文獻(xiàn)

[1] 李嬌. 利用QM-FISH技術(shù)分析EGFR與AKT1基因拷貝數(shù)與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性. 天津醫(yī)科大學(xué)， 2015.

[2] 王海丞， 李翠英. 纖維連接蛋白EDA片段在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的功能研究進(jìn)展. 口腔醫(yī)學(xué)研究， 2007， 23（4）：456-459.

[3] 楊月， 王海丞， 彭靖， 等. 纖維連接蛋白EDA片段的病理學(xué)研究進(jìn)展. 口腔醫(yī)學(xué)研究， 2016， 32（5）：538-540.

[4] 金承龍， 金玟言， 金珊， 等. 中波紫外線(xiàn)對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞纖維連接蛋白及EDA、EDB表達(dá)的影響. 中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志， 2018， 32（6）：18-21.

[5] 蔣瑞芳， 楊月， 李翠英. 纖維連接蛋白EDA片段與腫瘤相關(guān)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路. 北京口腔醫(yī)學(xué)， 2014（5）：288-291.

[6] 蔡晶晶. 纖維連接蛋白EDA片段功能及臨床應(yīng)用前景研究進(jìn)展. 河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 37（5）：617-620.

[7] 余松. 皮膚成纖維細(xì)胞纖維連接蛋白及其EDA、EDB表達(dá)與損傷時(shí)間的關(guān)系. 法醫(yī)學(xué)雜志， 2007（3）：188-190.

[8] 唐安明. 修飾的寡肽及其在分子影像和超分子水凝膠中的應(yīng)用研究. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)， 2015.

[收稿日期：2019-02-25]