豬源抗菌肽PR-39的抗菌性能及其熱穩定性的測定

付雪麗 田 奎 劉凱迪 王浩杰 劉保國 李月濤 胡建和

(河南科技學院,河南新鄉 453003)

抗菌肽（AMPs）是生物體內經誘導產生的一種具有生物活性的小分子多肽。天然生物抗菌肽抗菌譜相對較為廣泛，在特性上表現出突出的水溶性、熱穩定性，在高等動物正常細胞環境中，不存在毒害性，且不易產生耐藥性。據統計，在各種動物組織中發現具備抗菌特性的多肽、蛋白質種類已超出千種，且有70余種的結構已被測定。豬源抗菌肽PR-39是抗菌肽中的重要一種，它是從豬體內分離得到的抗菌肽，具有良好的抑菌效果。本試驗通過對抗菌肽的最小抑菌濃度進行測定，檢測耐熱性等，為該類產品應用于畜牧科研領域提供一定的數據與資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用的抗菌肽PR-39通過質譜鑒定，其純度指標超出了98%，系上海吉爾生化企業生產產品。在本分析中，選用的鼠傷寒沙門氏菌CVCC541、金黃色葡萄球菌（923）鼠 傷均購自中國獸醫藥品監察所。①液體培養基：MH液體培養基200ml高壓滅菌20min，121℃②固體培養基：LB固體培養基每100ml需加胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，另加瓊脂粉1.5g（高壓滅菌20min，121℃，備用）。

1.2 方法

1.2.1 產品配制

選取一定量的抗菌肽產品，要求使用無菌蒸餾水進行配置，配置溶液的標準濃度為1、2mg/ml。

1.2.2 抗菌肽產品抗菌活性的測定

（1）雙層瓊擴法測定抑菌活性

在這里應用的是LB固體培養基，即一般的瓊脂培養基，進行4h時間的活化培養，然后對菌液濃度進行稀釋處理，處理標準要求達到106～107CFU/ml。然后對活化后的細菌進行兩次離心來達到純化的目的。吸取純化后的菌液于裝有LB固體培養基中（此時為液體狀態，溫度大約50℃左右），每100ml培養基中加入334μl的菌液。將培養基倒入瓊脂板中，等待凝固后進行打孔，每個板打三個孔，分別注入20μl濃度為2mg/mL的抗菌肽、20μl相同濃度的氨芐霉素、20μl的水（陰性對照）。將平板放入培養箱內，溫度設定為37℃，在培養24h后對小孔周圍作仔細觀察，記錄是否出現菌圈與菌圈具體的規模。

（2）最小抑菌濃度的測定（MIC測定）

將細菌在LB固體培養基平板上進行劃線培養，然后放37℃恒溫培養16-18h左右。挑取菌落接種到5mlMH液體培養基中，放搖床上，37℃，180rmp/min，大約搖12h左右。吸取100μl菌液于4.5mlMH液體培養基繼續放在搖床上，180rmp/min搖4h活化（此時菌液濃度為108CFU/ml）。然后用MH液體培養基將上述菌懸液以1：1000比例進行稀釋，使菌液濃度達到105.CFU/ml。向96孔板每孔中分別加入100μl混勻后的MH菌懸液至第11排。吸取100μl濃度為1mg/ml的抗菌肽溶液添加到第一個孔中，反復吹打均勻，盡量不要有氣泡，（槍頭最好在液面以下吹打），然后從第一個孔中吸取100μL液體至第二個孔中，吹打均勻，以此類推，重復此操作至第10孔，吸取100μl液體棄去，此時每孔中的抗菌肽濃度分別為：2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、單位：mg/ml）。第11孔中不加抗菌肽，作陰性對照。第12孔中加入50μl濃度為1mg/ml的抗菌肽溶液與50μl的空白MH培養基，作陽性對照。將96孔板蓋上蓋子置于恒溫培養箱中培養，培養溫度設定為37℃，時間控制在16～18h范圍內，對細菌最小抑制濃度進行分析與記錄。

1.2.3 抗菌肽產品熱穩定性的測定

完成各種濃度藥液配置之后，將溶液置于99.2℃的沸水環境中進行水浴，水浴時間分別設定為5、10、20、30min，然后分別記錄其對鼠傷寒沙門氏菌所表現出的抑制效果。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽抗菌活性的測定

2.1.1 抗菌肽的抗菌活性效果

經過仔細對比，同濃度下抗菌肽PR-39的抑菌圈的直徑長度發現，如圖1所示，圖（a）直徑長度約11mm，圖（b）直徑長度約為12.6mm，圖（c）直徑長度約為14.6mm，說明抗菌肽PR-39的抑菌效果確實明顯。金黃色葡萄球菌加入抗菌肽PR-39的抑菌效果如圖2所示。

圖1 鼠傷寒沙門氏菌標準菌株

圖2 金黃色葡萄球菌標準菌株

鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌加入抗菌肽（A表示2mg/ml的氨芐霉素，P表示2mg/ml抗菌肽產品PR-39，水是陰性對照）

2.1.2 PR-39最小抑菌濃度的測定

采用2-10～2-1mg/ml10個濃度梯度，運用二倍稀釋法，結果發現第1～5孔中的菌液變得清澈透明，第6～11孔中菌液渾濁，所以鼠傷寒沙門氏菌的最小抑菌濃度為2-5mg/mL，試驗結果如圖3。

圖3 最小抑菌濃度測定試驗

2.2 抗菌肽產品熱穩定性的測定

完成各種濃度藥液配置之后，將溶液置于99.2℃的沸水環境中進行水浴，水浴時間分別設定為5、10、15、20、30min，然后分別記錄其對鼠傷寒沙門氏菌所表現出的抑制效果。具體可以觀看圖4。分析了解到，水浴分別為5、10、15min時，抗菌肽所表現出的抗菌效果是較為突出的，抑菌圈相對偏大。而在水浴20、30min時，雖仍存在有抑菌圈，但很明顯抑菌圈變小。這意味著，抗菌肽產品在高溫條件下仍可以發揮作用，但隨時間增加，其對鼠傷寒沙門氏菌的抑制性能有所減弱。

圖4 不同溫度對抗菌肽產品抗菌活性的影響

3 討論

3.1 抗菌肽產品抗菌性能和最小抑菌濃度

依據試驗觀察可知，該抗菌肽產品具備相當好的抗菌性能，對鼠傷寒沙門氏菌表現出十分優秀的抑制性能，而對于金黃色葡萄球菌而言，其抑菌圈并不顯著，這也表明，這兩種細菌對抗菌肽產品的敏感性是存在著明顯差異的。本次試驗是用雙層瓊擴法測出抗菌肽PR-39在濃度為2mg/ml時對金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌都具有抑菌性，但對鼠傷寒沙門氏菌的抑制效果較好。隨后以鼠傷寒沙門氏菌為試驗菌做抗菌肽PR-39最小抑菌濃度測定，試驗結果最小抑制濃度表現為10-5mg/ml。在對多種指標進行全面考慮的基礎上，可以將10-5mg/ml界定為最佳濃度。該濃度標準不僅可以降低抗菌肽產品的應用量，還可以有效保障抗菌效果達到預期。彭榮在分析過程中，通過粉紋夜蛾離體細胞對抗菌肽性能作了進一步分析，其試驗發現，這類抗菌肽的抗微生物活性相對較廣，抑菌活性較為突出，尤其是針對植物病原真菌中的小麥赤霉病菌、花生白絹病菌，革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌、沙門氏菌，酵母菌的白色念珠茵等作用突出。在這些抑菌活性中，效果最佳的是白色念珠菌、大腸桿菌，其次則是金黃色普通球菌，其他菌種效果偏弱。在2008年，劉慧明等人針對鱟抗菌肽作了深入的試驗與分析，發現其對枯草桿菌、隱球菌有著十分突出的抑制作用，但分析也發現，該類抗菌肽對于變形桿菌沒有作用。此外，更多的分析與大量的數據也表明，抗菌肽種類不同，在實際應用中的抗菌性能也表現出一定的差異，且所對應的最小抑制濃度也并不一致。從抗菌機理的視角來闡釋，即抗菌肽可以對細菌質膜結構作出改變或破壞，繼而引起膜穿孔，從而生成溶質通道或離子，促使細胞內容物大量滲出，繼而讓細菌失去活性并死亡，也可以對細菌的呼吸進行抑制，或阻礙細菌蛋白質的合成等。

3.2 溫度對抗菌肽產品抑菌活性的影響

許兵紅等在深入分析之后了解到，對于果絲光綠蠅幼蟲，選擇應用針刺誘導的方式獲得抗菌肽，然后在100℃沸水中進行一分鐘水浴，此時其仍存在著良好的抗菌活性，但在水浴持續三分鐘時間后，其活性會喪失。如選擇在80℃與60℃水溫中進行水浴，持續五分鐘后仍存在著抗菌活性。這也表明，該類抗菌肽抑菌活性存在著一定熱穩定性，溫度不同，熱穩定性也存在著變化。針對稻蝗抗菌肽、乳酪蛋白來源抗菌肽也做了相應的分析，發現溫度過高，也會導致其抑菌效果下降。在本分析中使用的抗菌肽PR-39，通過高溫處理仍存在著較好作用，表明其熱穩定性較為優秀。在100℃沸水中進行水浴，持續30min依然對鼠傷寒沙門氏菌表現出突出的抑制性能，但超出30min后，其抗菌圈已是十分小，且周圍分布有細菌，這也意味著其抗菌性逐漸喪失，這些研究成果與以上學者分析結果一致。

3.3 抗菌肽PR-39的抗菌機理

對于細菌本身而言，其存在著細胞壁與細胞膜，這也會對抗菌肽構成抵抗力，細胞中的脂多糖在抵抗抗菌肽中發揮著突出作用，為此，在應用中需要思考采取一定的方法，將革蘭氏陰性菌脂多糖凈負電荷減少，這樣便可以降低脂多糖的抵抗作用。抗菌肽抗菌機理的分析較多，主要表現為：其一，對細菌呼吸作用進行抑制處理，繼而引起線粒體空泡化、腫脹與排列不規則，導致核膜缺乏界限，引起細胞內容物流出；其二，對細胞壁合成進行抑制，即抑制細胞正常生長，促使細胞壁穿孔，繼而讓細胞死亡，但這種方式對已存在的細胞壁不發揮作用[10]；其三，穿模，即對細胞內結構或膜進行破壞；其四，對蛋白質合成進行抑制，即降低蛋白質合成，抑制細胞正常生長。幾乎所有的抗菌肽都是陽離子型，大多具有α螺旋和/或兩親β折迭結構。由于PR-39殺死正在生長的細菌比處于非生長狀態的細菌要快的多，所以PA-39的殺菌機理可能是通過阻斷細菌蛋白質和DNA的合成而殺滅細菌。因抗菌肽分子α-2螺旋存在著兩親性特征，為此，在抗菌肽分子聚合的過程中，會生成一定的離子通道，繼而引起陽離子向外流動，從而讓細菌防護喪失，無法維持正常的滲透壓，從而促使細菌死亡。

4 結論

通過一系列的試驗與分析可知，抗菌肽PR-39特性主要表現為：①抗菌性能顯著，特別是對鼠傷寒沙門氏菌，有著優秀的滅殺效果，對于金黃色葡萄球菌也存在著一定的抑制性，對鼠傷寒沙門氏菌的最低抑菌濃度為10-5mg/ml。②熱穩定性較為突出，在高溫環境中持續5～15min時，其抗菌活性仍較為顯著，但隨時間延長，活性會逐漸下降并最終喪失。