肝組織中程序性死亡受體1與自身免疫性肝炎炎性反應的關系

何啟軍 符火 陳揚 許海霞

自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis，AIH)主要由異常自身免疫反應介導，與性別、年齡、病毒、遺傳等因素有關，但詳細機制并不明確[1]。有資料顯示，肝組織中程序性死亡受體1(Programmed death 1，PD-1)經調節T細胞分化和活化抑制傳導信號，對免疫細胞功能發揮負性調控作用，與類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥等免疫性疾病有關，并在原發性膽汁性膽管炎、AIH、慢性丙型肝炎患者肝內表達明顯，推測自身免疫性肝病的發生與PD-1密切相關[2]。本研究納入60例AIH患者進行系統分析，旨在探討PD-1與AIH炎性反應的關系。

資料與方法

一、 一般資料

納入海口醫院2015年11月至2018年11月收治的AIH患者60例，男12例，女48例，年齡18～65歲，平均(47.1±12.1)歲。另選同期60例健康體檢者為健康對照組，其中男14例，女46例，年齡18～67歲，平均(48.2±12.1)歲。按疾病活動程度，將60例患者分為AIH緩解期組18例，AIH活動期組42例。研究對象均簽署知情同意書，獲醫院醫學倫理委員會批準。納入標準：①參考《自身免疫性肝病診斷和治療指南》[3]中AIH診斷標準，免疫球蛋白G或γ-球蛋白或總血清球蛋白濃度為正常上限1.5倍以上；血清天門冬氨酸氨基轉移酶、谷氨酸轉氨酶、堿性磷酸酶、谷氨酰轉肽酶異常；血清抗體檢測示平滑肌及血清抗核抗體或抗肝/腎微粒體抗體1型抗體滴度為1∶80以上；HAV和HBV陰性，肝組織學示界面性肝炎中或重度；②入組前30 d內無肝毒性藥物服用史；③年齡≥18歲，首次發病，且為Ⅰ型AIH。排除標準：①嚴重心腦血管疾病及消化、呼吸系統疾病；②藥物性、遺傳代謝性、酒精性肝病等所致肝功能異常者；③合并肝性腦病、重疊綜合征，或其他感染性疾??；④入組前3個月內服用糖皮質激素、甲氨蝶呤等；⑤精神疾患；⑥白細胞減少<2.5×109/L；⑦妊娠或哺乳期婦女。

二、肝組織PD-1檢測

1.主要儀器與試劑：LH50A 型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、DHP-9052型電熱恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)、MNl620型巴德一次性全自動活檢槍(美國巴德公司)、HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(武漢清平影像技術有限責任公司)。兔抗人PD-1抗體(英國Abcam公司)、二抗試劑盒SP-9001(北京中杉金橋生物技術有限公司)，二氨基聯苯胺顯色試劑盒購自英國Abcam公司。

2.標本處理：采用巴德一次性全自動活檢槍，抽吸出索狀肝組織(長約20 mm)，匯管區為8個及以上，4%甲醛固定24 h，石蠟包埋后連續切片(厚度約4 μm)，予以標記。通過烤片、脫水、封閉內源性過氧化物酶、抗原修復、滴加一抗、二抗及孵育、復染等處理后，高倍鏡下觀察20個視野，行免疫組織化學染色結果判定。由2名經驗豐富的病理科醫師采用雙盲法閱片。

3.PD-1檢測：采用免疫組織化學卵白素-生物素-酶復合物染色法進行PD-1檢測，表達工作濃度1∶200，通過3%雙氧水作用、抗原修復后，加入兔抗人PD-1抗體，4℃培養過夜，第2天清晨加入第二抗體，行顯色、復染等處理。以PD-1陽性切片為陽性對照，并以磷酸鹽緩沖液代替一抗為陰性對照。陽性判定：肝細胞包膜和胞質出現棕黃色顆粒。

4.圖像分析：采用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統，每張切片取高倍視野5個，檢測肝組織PD-1平均吸光度值、積分吸光度值，測量5個視野均值。

三、實驗室指標檢測

清晨空腹采血3 mL，離心后取上層血清，運用uniceL DxC800型全自動生化分析儀，總膽紅素試劑盒購自寧波普瑞柏生物技術股份有限公司；丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶，試劑盒購自上海復星長征醫學科學有限公司；采用免疫比濁法檢測免疫球蛋白A、G、M，試劑盒均購自美康生物科技股份有限公司。

四、觀察指標

統計緩解期組與活動期組一般資料，觀察各組PD-1陽性表達率，分析PD-1表達與肝臟炎性反應的關系，并探討PD-1表達與總膽紅素、丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶的相關性。肝組織炎性反應判定[4]：按標本組織中肝細胞變性、壞死、炎性細胞浸潤程度、匯管區纖維增生、纖維分隔形成病理改變狀況，進行肝組織炎癥活動度(G)分級，包括G0～G4級，其中無炎癥：G0級；輕度炎癥：G1～G2級；重度炎癥：G3～G4級。

五、統計學方法

結 果

一、AIH緩解期與活動期組基線資料比較

AIH緩解期組總膽紅素、天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、免疫球蛋白G顯著低于AIH活動期組(P<0.05)，其他指標比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

二、 各組研究對象PD-1陽性表達率比較

AIH組PD-1陽性表達率為(13.58±6.82)%，顯著高于健康對照組的(2.23±0.67)%，差異有統計學意義(t=12.829，P<0.01)。AIH活動期患者肝組織病理學改變多表現為界面性肝炎，伴匯管區炎性細胞(單核細胞、漿細胞、淋巴細胞)浸潤，多數肝小葉內見碎屑樣或點狀壞死，匯管區炎癥未侵犯膽管系統，PD-1陽性表達率為(16.52±7.70)%。AIH緩解期組未發現界面性肝炎，匯管區無漿細胞、淋巴細胞浸潤及壞死，PD-1陽性表達率為(6.54±3.14)%。AIH活動期組PD-1陽性表達率顯著高于AIH緩解期組及健康對照組，差異有統計學意義(t=5.293、7.823，均P<0.01)，見圖1。

三、 PD-l與肝臟炎癥的關系

60例AIH患者中，肝組織炎癥活動度G0級18例、G1～G2級23例、G3～G4級19例，PD-1陽性表達率依次為(6.57±3.14)%、(14.30±5.05)%、(19.24±5.46)%。其中，G0級AIH患者PD-1陽性表達率顯著低于G1～G2級、G3～G4級(t=5.683、8.588，均P<0.01)，G1～G2級AIH患者PD-1陽性表達率顯著低于G3～G4級(t=3.042，P=0.004)，見圖2。

四、 PD-1與總膽紅素、天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶的相關性

直線相關分析顯示，PD-1表達與總膽紅素、天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶呈正相關(r=0.853、0.863、0.884，均P<0.01)，見圖3～5。

討 論

本研究結果顯示，肝炎組PD-1陽性表達率明顯高于健康對照組，而理論上AIH患者PD-1陽性表達率應明顯下降，可能是機體為了應對自身免疫反應而產生的一種代償機制，但PD-1上調并不能控制疾病發生及發展?？吕び頪5]等也發現，AIH 患者肝組織PD-1表達明顯高于健康對照組，提示其可能參與AIH的發病。此外，AIH活動期組PD-1陽性表達率明顯高于AIH緩解期組，間接說明肝內浸潤性T淋巴細胞已激活，發揮生物學功能，證實免疫抑制劑(如硫唑嘌呤、糖皮質激素等)可能經抑制T細胞活化，降低PD-1表達。有資料顯示，表達PD-1的T、B細胞與其配體PD-L陽性細胞相互作用，能促使B、T細胞免疫效應下降，引起自身反應性淋巴結細胞功能受抑，進而預防外周組織被自身免疫攻擊，證實其參與炎癥病理發生、發展過程[6]。這可能是在共刺激通路中，PD-1/PD-L信號通路出現功能障礙，或正性刺激信號過強，遠遠高于負性抑制信號抑制免疫反應作用，引起機體免疫耐受紊亂，導致其無法實現免疫反應抑制性調控作用，最終誘導疾病發生。

表1 AIH緩解期組與活動期組基線資料比較

圖1 各組患者肝組織中PD-1表達 A.健康對照組；B.AIH緩解期；C.AIH活動期

圖2 AIH患者肝組織中PD-1表達 A.G0級AIH患者；B.G1～G2級AIH患者；C.G3～G4級AIH患者

圖3 PD-1與總膽紅素的線性相關圖

圖4 PD-1與天冬氨酸氨基轉移酶的線性相關圖

圖5 PD-1與丙氨酸氨基轉移酶的線性相關圖

本研究發現，G0級AIH患者PD-1陽性表達率明顯低于G1～G2級及G3～G4級，且G1～G2級AIH患者PD-1陽性表達率明顯低于G3～G4級，與熊克宮等[7]報道相似，提示隨著肝組織炎癥活動的逐漸加重，患者PD-1陽性表達率呈明顯上升趨勢，證實PD-1與AIH炎性反應有關。另外，本研究結果顯示，PD-1表達與總膽紅素、天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶呈正相關，提示PD-1與肝臟炎癥活動程度有關。Darb-Esfahani等[8]也發現，AIH患者肝組織PD-1呈高表達，與纖維化分級無明顯關聯，但與肝組織炎癥活動度有關，表明PD-1參與AIH炎癥發生、發展。筆者認為，PD-1與肝臟炎癥活動有關，可能是肝臟炎性反應加重時機體的一種自我保護機制。具體而言，肝臟存在明顯免疫介導的炎性反應活動時，機體免疫反應強，為預防肝組織損傷，機體PD-1呈高表達，抑制T細胞活性，誘導免疫應答下降，證實肝組織PD-1表達與病情慢性化進展相關。而PD-1/PD-L信號通路是AIH免疫逃逸的關鍵機制，在AIH發生、發展中起著重要作用，早期檢測PD-1利于評估肝臟病理程度。

綜上，AIH患者PD-1與肝臟炎性反應密切相關，臨床上應引起足夠重視。但本文樣本量較少，干預時間較短，所得結論可能存在一定偏差。Zou等[9]報道，部分肝癌患者肝組織中PD-1表達上調，其預后比PD-1低表達者差，提示PD-1對腫瘤預后有一定作用。本文未涉及PD-1與AIH患者預后的關系，有待今后開展多中心、大樣本的隨機對照實驗，以深入探索其機制。