新型分化培養基增強HepG2肝細胞功能的研究

王振宇 李偉建 張洪丹 景宏舒 袁天杰 彭媛 鄢和新 翟博

HepG2細胞是一種已經被廣泛表征的人肝癌細胞系，具有諸如容易大量獲取，易處理和無限壽命等優點，是最常用的肝細胞模型；然而，HepG2較低的肝細胞功能，在一定程度上妨礙了其的應用[1]。

研究報道，一些特定小分子具有改善肝細胞功能，促進細胞分化的作用，采用含有特定小分子組合的肝細胞成熟培養基(HMM)可成功將肝細胞衍生的肝祖細胞樣細胞(HepLPC)分化為成熟肝細胞[2-6]。本研究觀察了這種新型肝細胞成熟培養基對HepG2的作用，并以此為基礎建立新的三維HepG2培養體系，旨在降低因HepG2低功能帶來的不利影響，更好的服務于相關研究。

資料與方法

一、 細胞培養

冷凍保存的HepG2細胞系購自中國科學院(上海)細胞庫。37℃水浴解凍后，將細胞培養在含有10%胎牛血清(Biological Industries)和1%青鏈雙抗(源培生物科技股份有限公司)的DMEM(源培生物科技股份有限公司)中，然后將細胞置于37℃、體積分數為0.05的CO2細胞培養箱中進行培養。每2～3天更換一次培養基，細胞覆率超過80%時使用0.25%的胰酶(源培生物科技股份有限公司)進行消化，并按照1∶3～6的比例接種入新的培養皿中。

二、 HepG2的2D功能提升培養

將狀態良好的HepG2接種在細胞培養板中，并在DMEM完全培養基中培養1～3 d直至細胞覆率達到60%～80%。然后將培養基更換為肝細胞成熟培養基(HMM)[5-6]。另外培養7～9 d以誘導HepG2的功能提升。HMM基于DMEM/F12，補充有N2和B27(均購自源培生物科技股份有限公司),10 μmol DAPT(TargetMol)，20 ng/mL OSM(Peprotech)，10 μmol地塞米松(Sigma-Aldrich)，10 μmol SB431542(TargetMol)。培養基每2～3天更換1次，誘導前后的顯微照片使用Nikon Ta2-FL捕獲。

三、 HepG2的3D功能提升培養

將狀態良好的HepG2以1～2×106每孔的數量接種入6孔低黏附板(CORNING)。細胞最初培養于DMEM完全培養基中，24～48 h形成穩定的3D結構。之后，將培養基更換為HMM培養7～9 d，以進一步提升肝功能。 培養基每2～3天更換1次。

四、 實時熒光定量PCR

使用Trizol試劑(碧云天生物科技有限公司)提取總RNA，使用BeyoRTTMIII cDNA第一鏈合成試劑盒(碧云天生物科技有限公司)合成cDNA。 通過使用ABI 7 300PLUS實時PCR儀(Life Technologies)和SYBR Green qPCR Mix(2X，High ROX)(碧云天生物科技有限公司)進行QPCR分析。使用ΔΔCt方法分析基因轉錄數據并歸一化到管家基因18s。 引物由上海華津生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

五、過碘酸-希夫染色

使用南京建成生物工程研究所的糖原染色試劑盒進行過碘酸-希夫染色以檢測糖原合成情況，染色完成后使用Nikon Ta2-FL拍攝顯微圖像。

六、尿素檢測

在含有3 mmol NH4Cl的HMM中培養2D及3D培養物。NH4Cl誘導后24 h收集上清液。QuantiChromTM尿素測定試劑盒(BioAssy Systems，USA)檢測尿素濃度。 所有數據均經過時間和總蛋白量校正。

七、氯丙嗪毒性檢測

將1×106的HepG2細胞接種在384孔微球板中(CORNING)，并以200×g離心3 min。 接種2～3 d后，將50%的培養基更換為HMM或者新鮮的DMEM完全培養基。之后，每隔1天更換50%的培養基。培養9 d后，將細胞球暴露于一定濃度梯度的氯丙嗪中，暴露48 h后，使用PrestoBlueTMCell Viability Reagent(Invitrogen)定量細胞活力。毒性結果總結為歸一化的劑量依賴性毒性曲線和50%毒性濃度(TC50)值。

八、統計學處理

通過GraphPad Prism 7軟件進行統計學分析，采用student’st檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

表1 引物序列

結 果

一、 HMM明顯提高了HepG2的肝細胞功能

相對于DMEM培養的HepG2細胞(HepG2-2D-DMEM)，HMM培養7 d的HepG2細胞(HepG2-2D-HMM)形態明顯改變，表現為細胞增大，細胞內出現多個細胞核，胞質內顆粒豐富(圖1 A,B)。PAS檢測顯示HepG2-2D-HMM相對于HepG2-2D-DMEM呈明顯陽性結果(圖1 C,D)，表明細胞合成糖原的能力明顯增強。

注：A. DMEM培養的HepG2;B.與HMM培養的HepG2；C. DMEM培養的HepG2的PAS;D. HMM培養的HepG2的PAS

圖1HMM培養HepG2前后的形態及PAS改變

對于5種主要肝細胞功能基因的QPCR顯示HMM明顯提高了HepG2的肝細胞功能基因的表達(表2)。其中，相對HepG2-2D-DMEM，HepG2-2D-HMM的主要藥物代謝酶CYP3A4表達上調4.7±0.18倍(t=18.6,P<0.01)；HBV受體NTCP表達上調1.3±0.1倍(t=8.929，P<0.01)；氨解毒及尿素循環關鍵酶CPS1表達上調4.9±0.2倍(t=19.36，P<0.01)；血漿蛋白Alb表達上調1.4±0.1倍(t=5.708，P<0.05)；糖異生關鍵酶G6PC表達上調5.6±0.1倍(t=13.14，P<0.01)。

二、HMM聯合3D培養提升HepG2的肝細胞功能

為了進一步提升HepG2的肝細胞功能，建立了HMM聯合3D培養的HepG2培養體系(HepG2-3D-HMM)。懸浮在6孔低黏附板內的單個HepG2細胞在6～12 h內開始聚集，并在24～48 h內形成比較穩定的3D結構(圖2)，隨后繼續使用HMM培養7 d以提高細胞功能。尿素產生檢測顯示，相對于HepG2-2D-HMM，HepG2-3D-HMM的尿素合成能力大幅提升，由HepG2-2D-HMM的0.20±0.04 μg/mg protein/day提升到HepG2-3D-HMM的(88±20) μg/mg protein/day，差異有統計學意義 (t=4.475,P<0.05)。

圖2 HepG2-3D-HMM的顯微照片

對于5種主要肝細胞功能基因的QPCR揭示了肝細胞功能基因表達水平的進一步提升(表2)。結果顯示，在這5種基因的表達情況中，除Alb外(t=1.024，P=0.41)，CYP3A4(t=9.176，P<0.05)、NTCP(t=30.76，P<0.01)、CPS1(t=6.371，P<0.05)、G6PC(t=64.27，P<0.01)均獲得明顯改善。

三、 HMM有利于更準確的預測肝毒性藥物

與3D環境下使用DMEM培養的HepG2細胞(HepG2-3D-DMEM)相比，HepG2-3D-HMM對氯丙嗪急性肝毒性的敏感性大幅提高(圖3)。盡管HepG2-3D-HMM對氯丙嗪的TC50(85±7)μmol/L與原代肝細胞對氯丙嗪的TC50(25±5)μmol/L有一定差距(t=10.91,P<0.01)，但仍顯著優于HepG2-3D-DMEM對氯丙嗪的TC50(254±36)μmol/L(t=7.982,P<0.01)，這表明HMM顯著改善了HepG2對于氯丙嗪毒性的預測能力。

表2 HepG2-2D-HMM及HepG2-3D-HMM相對HepG2-2D-DMEM的肝功能基因表達量

注：與HepG2-2D-DMEM相比，at=18.6,bt=8.929,ct=5.708,dt=19.36,et=13.14； 均P<0.05。與HepG2-2D-HMM相比，ft=9.176,gt=30.76,ht=1.024,it=6.371,jt=64.27; 除hP=0.41外, 余均P<0.05

討 論

肝細胞廣泛用于多種領域，然而，原代人肝細胞的諸多缺陷嚴重限制了其應用。作為目前使用最廣泛的永生肝細胞模型之一，HepG2肝癌細胞系已用于藥物誘導的肝毒性評估[1]。然而，HepG2細胞系的藥物代謝基因表達水平低下[1]。為了克服這個缺點，我們開發了一種肝細胞成熟培養基(HMM)，前期工作表明，HMM可以快速將肝細胞來源的肝祖細胞樣細胞(HepLPCs)分化成成熟的肝細胞[5, 6]。在本研究中，HMM被證明能夠快速誘導HepG2的功能提升。與DMEM培養的HepG2相比，HMM培養的HepG2一方面表現出更接近成熟肝細胞的形態、更強的糖原合成能力，另一方面其多個肝細胞基因表達水平，特別是代謝了超過1/3的藥物的CYP3A4的基因表達水平，同樣得到顯著提升。這無疑會在一定程度上緩解HepG2較低的肝細胞功能帶來的影響。

越來越多的證據表明，在3D環境中培養細胞可以顯著改善其肝功能[7，8]，盡可能的模擬體內肝臟復雜性一直被認為是再生醫學，藥物開發和生物技術領域的主要挑戰[9]。本研究聯合3D培養及HMM誘導，建立了HepG2-3D-HMM模型。所得的HepG2-3D-HMM，相對于HepG2-2D-HMM，多個肝細胞基因表達水平明顯得到提高。為了進一步驗證HMM在HepG2的3D培養物中的重要作用，對比了HepG2-3D-HMM以及HepG2-3D-DMEM對已知肝毒性藥物氯丙嗪的48 h急性肝毒性的預測能力，結果顯示，HMM顯著改善了HepG2的3D培養物對氯丙嗪肝毒性的敏感性，其TC50更接近于文獻報道的原代人肝細胞的TC50，因此HMM聯合3D培養將極大的促進HepG2在制藥工業中的應用并減少藥物誘導肝損傷的發生率。除此之外，相對于HepG2-2D-HMM，HepG2-3D-HMM尿素合成能力的大幅提升，已經超過了文獻中報道的幾種生物人工肝常用細胞的尿素合成能力[10]。這說明其在生物人工肝方面應用的潛力。

綜合上述，聯合3D培養，所培養的HepG2細胞功能會進一步提升，使其更適于藥物肝毒性篩查甚至是生物人工肝的建立。